羅格列酮對膿毒癥大鼠急性肺損傷保護作用的研究

靳希成秦海東孫才智沈華張錚

目的探討羅格列酮對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護作用及其機制。方法按隨機數(shù)字法,將54只健康清潔級雄性大鼠,隨機分為3組,分別為對照組(C組),膿毒癥急性肺損傷模型組(L組),羅格列酮治療組(T組)。采用腹腔注射內(nèi)毒素脂多糖(LPS)的方法建立膿毒癥急性肺損傷模型,分別于注射LPS后3 h、6 h、12 h進行心臟取血。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平,取肺組織做HE染色,觀察肺組織光鏡下的病理學(xué)改變,測肺濕/干重比值(W/D),并采用western-blot法檢測肺組織血紅素加氧酶(HO-1)蛋白的表達。結(jié)果與C組相比，L組和T組各時間點大鼠肺的W/D比值顯著增加(P均<0.01)；與L組比較,T組6、12 h時W/D顯著降低(P<0.01)。與C組比較，L組與T組各時間點血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P均<0.05)；與L組比較,T組各時間點血清TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.01或P<0.05)。與C組相比,L組6、12 h時HO-1蛋白表達顯著增高(P<0.01)；與L組比較,T組各時間點HO-1蛋白表達顯著增高(P<0.01)。結(jié)論預(yù)先加入羅格列酮可以對膿毒癥大鼠急性肺損傷起保護作用,其機制可能與提高肺組織HO-1蛋白表達,減輕膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

羅格列酮; 膿毒癥; 血紅素加氧酶-1; 過氧化物酶體增值物激活受體γ

膿毒癥作為一種臨床上常見的危急重癥,是由感染引起的一種全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)[1],其病死率高。在膿毒癥誘導(dǎo)的多器官功能衰竭中,肺臟是最早發(fā)生衰竭的器官之一。而事實上,呼吸衰竭是膿毒癥病人的主要死因[2]。血紅素加氧酶(heme oxygenase-1,HO-1)又名熱休克蛋白32,參與包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增殖、以及免疫調(diào)節(jié)等一系列細胞保護過程[3]。羅格列酮(ROSI)作為過氧化物酶增值激活受體γ(PPAR-γ)的特異性激活劑,近年來其抗炎作用機制引起了大家的重視[4-6]。但關(guān)于ROSI是通過何種機制參與膿毒癥抗炎反應(yīng)的研究,國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本實驗旨在通過觀察ROSI對膿毒癥大鼠急性肺損傷(ALI)的影響,探討其對肺組織損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 ROSI(大連美侖生物科技有限公司),內(nèi)毒素脂多糖(LPS)(美國Sigma公司),HO-1 (博士得生物公司),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(武漢USCN公司),白介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(武漢USCN公司)。

1.2 實驗動物分組與模型制備 健康成年雄性清潔級SD大鼠54只,體質(zhì)量250～300 g,由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院實驗動物中心提供。采用隨機數(shù)字法將大鼠平均分成對照組、ALI模型組以及ROSI治療組。參照文獻[7]方法,大鼠經(jīng)腹腔注射LPS 10 mg/kg制備膿毒癥大鼠ALI模型。ALI模型組和對照組分別在腹腔注射LPS或等體積生理鹽水前24 h和前30 min腹腔注射10%二甲基亞砜(DMSO)(1 ml/kg)。ROSI治療組在腹腔注射LPS前24 h和前30 min腹腔注射10%DMSO+ROSI(10 mg/kg),本實驗中動物處理方法符合動物倫理學(xué)標準。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 肺組織濕/干質(zhì)量(W/D)比值的測定:取大鼠左肺組織吸干血跡后稱濕質(zhì)量,再置入80℃烘箱48 h至恒重后稱干質(zhì)量,計算兩者比值。

1.3.2 大鼠血清TNF-α、IL-6含量的測定:大鼠用10%水合氯醛麻醉后,左心室取血2 ml,常溫靜置2 h,離心取上清液,采用ELISA法檢測血清各指標水平,操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3.3 western-blot 檢測HO-1:按照western蛋白提取試劑盒說明書提取肺組織蛋白后保存在-80 ℃的冰箱待用。將肺組織蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜1 h,封閉1 h,加入多克隆兔抗HO-1,孵育過夜,加入辣根過氧化酶標記的兔抗鼠IgG(1∶1500),孵育,ECL顯影,曝光。采用Gel-Pro32軟件進行灰度分析,其目的蛋白HO-1與內(nèi)參灰度的比值即為目的蛋白的相對含量。

1.3.4 肺組織病理學(xué)觀察:取右肺上葉的小塊組織,于10%多聚甲醛中固定石蠟包埋,切為5 μm的切片行HE染色。光鏡下觀察肺組織病理改變。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 對照組大鼠毛皮光滑,反應(yīng)靈敏,呼吸平穩(wěn),活動自如。ALI模型組大鼠于注射LPS后30 min逐漸出現(xiàn)攝食減少、活動減少、呼吸頻率加快、精神萎靡、豎毛、寒戰(zhàn)、嗜睡等癥狀,并隨著時間的延長上述癥狀加重。ROSI治療組大鼠癥狀較ALI模型組明顯減輕。

2.2 肺組織病理變化 對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡壁薄,肺泡腔內(nèi)無滲出液和炎性細胞。3 h時ALI模型組大鼠肺泡間隔輕度增寬,少量炎細胞浸潤,可見毛細血管擴張充血。6 h時部分肺泡萎陷,肺泡間隔中度增寬,較多炎細胞浸潤,局灶見紅細胞滲出。12 h時,肺組織失去正常結(jié)構(gòu)部分實變,可見大量炎細胞呈片狀分布，并有小膿腫形成,肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)見灶性出血。與ALI模型組同時間點相比,ROSI治療組病理改變程度明顯減輕,12 h肺組織未見明顯出血灶,僅見較多炎細胞浸潤,見圖1。

A: 正常對照組; B:ALI模型3 h組; C:ROSI治療3 h組; D: ALI模型6 h組;E:ROSI治療6 h組;F:ALI模型12 h組;G:ROSI治療12 h組圖1 大鼠肺組織病理改變(HE，×200)

2.3 各組大鼠肺W/D比值的變化 3 h、6 h、12 h時間點各組間W/D比值比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=58.96;F=87.66;F=195.80,P<0.001)。與對照組比較,ALI模型組和ROSI治療組各時間點大鼠肺的W/D比值顯著增加(P<0.01),與ALI模型組比較,ROSI治療組肺W/D比值在6 h,12 h顯著降低(P<0.01),在3 h時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠肺組織W/D比值的變化

注:與同時間點對照組比較,**P<0.01;與同時間點ALI模型組比較,△△P<0.01

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6的變化 與對照組比較,ALI模型組各時間點血清TNF-α、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)。ROSI治療組各時間點血清TNF-α、IL-6水平較ALI模型組明顯下降(P<0.05)。ROSI治療組3 h、6 h血清TNF-α、IL-6水平較對照組顯著升高(P<0.05)。見表2，3。

組別3h6h12h對照組36.23±3.8538.31±5.0236.88±2.90ALI模型組74.26±8.59**60.81±9.23**50.34±11.73**ROSI治療組58.30±9.76**△△48.98±5.15*△△39.04±3.73△

注:與同時間點對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與同時間點ALI模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

組別3h6h12h對照組15.35±2.6114.97±1.8915.42±1.68ALI模型組251.72±39.19**52.32±7.11**21.55±4.46**ROSI治療組148.27±30.71**△△37.58±6.36**△△16.72±2.82△

注:與同時間點對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與同時間點ALI模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.5 各組大鼠肺組織HO-1蛋白量的變化 在ALI模型組,HO-1蛋白表達于6 h及12 h顯著上升(P<0.01)。ROSI治療組各時間點與對照組及ALI模型組相比顯著上升(P<0.01)。組內(nèi)比較,ALI模型組6 h較3 h顯著上升(P<0.01),12 h較6 h上升差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ROSI治療組6 h較3 h顯著上升(P<0.01),12 h較6 h顯著上升(P<0.01),見圖2。

注:C:對照組;L3: ALI模型3 h組;T3:ROSI治療3 h組;L6: ALI模型6 h組;T6:ROSI治療6 h組;L12: ALI模型12 h組;T12:ROSI治療12 h組；與L3組比較，P<0.01;與同時間點ALI模型組比較，bP<0.01,與同組內(nèi)3 h時間點比較，cP<0.01;與同組內(nèi)6 h時點比較，dP<0.01圖2 各組肺組織HO-1蛋白含量

3 討論

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,其進一步發(fā)展可以導(dǎo)致膿毒癥休克以及多器官功能障礙綜合征,成為臨床危重病人的主要死亡原因之一[8]。而在膿毒癥病情發(fā)展過程中,肺損傷往往是最早出現(xiàn)的。在動物ALI的模型中,LPS模型是最常用的模型之一。LPS是革蘭陰性菌細胞外膜成分,本實驗采用腹腔注射LPS(10 mg/kg)復(fù)制了膿毒癥ALI模型,結(jié)果顯示,與對照組比較,ALI組血清TNF-α,IL-6濃度及肺W/D比值顯著升高(P<0.05),結(jié)合病理學(xué)結(jié)果,提示大鼠膿毒癥肺損傷模型制備成功。

膿毒癥是一種失控的炎癥反應(yīng),而TNF-α是機體受到有害刺激后在單核巨噬細胞以及淋巴細胞最早分泌的,最關(guān)鍵的促炎細胞因子,它可以誘導(dǎo)IL-1、IL-6等細胞因子的產(chǎn)生,從而引發(fā)炎癥的級聯(lián)反應(yīng),使炎癥細胞在肺部大量聚集,引起肺組織損傷。已有大量研究表明,TNF-α和IL-6在膿毒癥休克肺損傷中起到了至關(guān)重要的作用[9-10]。此外,Ridemann等[11]實驗表明,血清IL-6水平和膿毒癥大鼠死亡率有關(guān),它可以作為菌血癥出現(xiàn)的一個早期診斷標志物,使用抗體去阻斷IL-6可以顯著提高膿毒癥大鼠的生存率。本實驗中,在ROSI治療組我們預(yù)先加入ROSI,發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠血清各時間點TNF-α和IL-6水平顯著降低,肺組織病理損傷明顯改善,這與Wu等[12]研究結(jié)果一致,提示ROSI對膿毒癥肺損傷的保護可能是通過降低血清TNF-α和IL-6來實現(xiàn)的。

HO-1是哺乳動物和人體內(nèi)血紅素代謝途徑中的限速酶。HO-1有3種同工酶,分別是HO-1、HO-2、HO-3,其中HO-2和HO-3主要在生理情況下作用于體內(nèi),而HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白,低氧、氧化應(yīng)激、炎癥等病理情況下都可以誘導(dǎo)HO-1表達大量增加[13],并在受損臟器大量聚集,從而對機體起到抗炎、抗氧化、抗凋亡等保護作用。已經(jīng)有體外和體內(nèi)研究表明,HO-1可以通過減弱MAPKs和NF-κB信號通路的激活,減少膿毒癥狀態(tài)下TNF-α及IL-6的產(chǎn)生[14-15]。同時Ge等[16]研究發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)ALI中HO-1的表達上調(diào),而當HO-1的活性被ZnPP抑制后,肺損傷加重,提示表達上調(diào)的HO-1對膿毒癥ALI起到了一定的保護作用。本實驗中,ALI模型組大鼠肺組織HO-1升高,表明LPS在誘導(dǎo)肺組織損傷的同時,也啟動了包括HO-1在內(nèi)的機體保護系統(tǒng),但因為表達水平太低而不能夠發(fā)揮有效的保護作用。而ROSI組,肺組織各時間點HO-1表達明顯上升,炎癥明顯下降。因此,我們推斷ROSI對炎癥的下調(diào)作用是通過上調(diào)HO-1來實現(xiàn)的。

PPAR-γ是一種依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,屬于核激素受體超家族的成員。被特定的配體激活之后,PPAR-γ進一步激活PPAR反應(yīng)元件啟動目標基因的轉(zhuǎn)錄。許多研究者認為HO-1是PPAR-γ下游的一個效應(yīng)基因,是PPAR-γ的直接靶向基因[17], PPAR-γ可以通過改變HO-1基因啟動子的多態(tài)性,促進HO-1蛋白的表達。而ROSI是高親和力的PPAR-γ激動劑。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在缺乏PPAR-γ信號的情況下,不能抑制炎癥因子的產(chǎn)生[18]。而且在面對氧化應(yīng)激壓力的情況下,在巨噬細胞中PPAR-γ可以穩(wěn)定HO-1 mRNA的基因表達,HO-1 mRNA的半衰期降低和PPAR-γ基因表達的缺乏成平行關(guān)系[19]。本實驗在預(yù)先加入ROSI的情況下,肺組織HO-1的表達呈現(xiàn)時間依賴性的增加,與同時點ALI模型組相比,肺組織W/D比明顯下降,炎癥指標和肺組織病理改變明顯減輕。因此,我們推測ROSI可以通過增加HO-1蛋白的表達,而降低炎癥反應(yīng),對損傷肺組織起到保護性作用。

綜上所述,ROSI能有效減輕膿毒癥大鼠ALI,其機制可能是通過提高肺組織的HO-1水平而減少各類炎癥因子表達來實現(xiàn)的,其保護作用呈時間依賴性,從而為臨床上治療ALI提供了新的思路。

[1] Kim SJ, Park JS,Lee DW,et al. Trichostatin a protects liver against septic injury through inhibiting toll-like receptor signaling[J]. Biomol Ther (Seoul), 2016, 24(4): 387-394.

[2] Zhou P,Ma B,Xu S, et al. Knockdown of Burton’s tyrosine kinase confers potent protection against sepsis-induced acute lung injury[J]. Cell Biochem Biophys, 2014, 70(2): 1265-1275.

[3] Chen X,Wei SY,Li JS, et al. Overexpression of heme oxygenase-1 prevents renal interstitial inflammation and fibrosis induced by unilateral ureter obstruction[J]. PLoS One, 2016,11(1): e0147084.

[4] 鄧佳，于健.羅格列酮對膿毒癥急性腎損傷大鼠腫瘤壞死因子-α表達的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志,2015, 95(19): 1479-1482.

[5] 鄧佳，于健.羅格列酮對膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2016,96(29): 2311-2315.

[6] 曾勉，黃曉梅，何婉媚，等.羅格列酮聯(lián)合頭孢他啶對膿毒癥大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ活性和白細胞介素的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2012,24(9): 550-553.

[7] 芮蕾,陳威丞,朱繼金,等. 雙聯(lián)抗血小板對膿毒癥大鼠血小板功能和急性肺損傷的影響[J]. 中國急救醫(yī)學(xué), 2015,35(2): 97-100.

[8] Dellinger RP,Levy MM,Rhodes A, et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012[J]. Intensive Care Med, 2013,39(2): 165-228.

[9] Singleton KD,Wischmeyer PE. Distance of cecum ligated influences mortality, tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 expression following cecal ligation and puncture in the rat[J].Eur Surg Res, 2003,35(6): 486-491.

[10]Bhatia M, Moochhala S. Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome[J]. J Pathol, 2004, 202(2): 145-156.

[11]Riedemann NC, Neff TA,Guo RF,et al. Protective effects of IL-6 blockade in sepsis are linked to reduced C5a receptor expression[J]. J Immunol, 2003, 170(1): 503-507.

[12]Wu WT, Lee CC,Lee CJ,et al. Rosiglitazone ameliorates endotoxin-induced organ damage in conscious rats[J]. Biol Res Nurs, 2011, 13(1): 38-43.

[13]Yu JB, Dong SA, Luo XQ, et al. Role of HO-1 in protective effect of electro-acupuncture against endotoxin shock-induced acute lung injury in rabbits[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2013,238(6): 705-712.

[14]Otterbein LE, Bach FH,Alam J,et al. Carbon monoxide has anti-inflammatory effects involving the mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Nat Med, 2000, 6(4): 422-428.

[15]Lee TS,Chau LY.Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of interleukin-10 in mice [J]. Nat Med, 2002, 8(3): 240-246.

[16]Ge ZJ,Jiang GJ,Zhao YP, et al. Systemic perfluorohexane attenuates lung injury induced by lipopolysaccharide in rats: the role of heme oxygenase-1[J]. Pharmacol Rep, 2010,62(1): 170-177.

[17]Kronke G,Kadl A,Ikonomu E, et al. Expression of heme oxygenase-1 in human vascular cells is regulated by peroxisome proliferator-activated receptors[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007,27(6): 1276-1282.

[18]Bouhlel MA, Derudas B,Rigamonti E,et al. PPARgamma activation primes human monocytes into alternative M2 macrophages with anti-inflammatory properties[J]. Cell Metab, 2007,6(2): 137-143.

[19]von Knethen A,Neb H,Morbitzer V,et al. PPARgamma stabilizes HO-1 mRNA in monocytes/macrophages which affects IFN-beta expression[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 51(2): 396-405.

Protectiveeffectsofrosiglitazoneonacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharideinrats

JINXi-cheng,QINHai-dong,SUNCai-zhi,SHENHua,ZHANGZheng.

DepartmentofEmergency,NanjingFirstHospital,Nanjing210006,China

ObjectiveTo investigate the protective effect of rosiglitazone on acute lung injury(ALI) in rats with sepsis and to explore the possible mechanism.MethodsFifty-four healthy male rats were randomly divided into three groups: control group(group C), acute lung injury of sepsis group(group L),rosiglitazone treatment group(group T).The acute lung injury model of sepsis was established by intraperitioneal injection of 10 mg/kg LPS. The levels of serum TNF-α and IL-6 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 3 h,6 h,12 h after injection of endotoxin. The lung tissue was stained with hematoxylin and eosin(HE) and observed under light microscopy. The lung wet to dry weight ratio was measured, and the expression of HO-1 protein was detected by western blot.ResultsCompared with group C,W/D of lung tissue in group L and group T was significantly higher at each time point. Compared with group L, W/D of lung tissue in T group was significantly lower 6 h and 12 h after injection of LPS.The concentration of TNF-α and IL-6 in group L reached the peak 3 h after injection of LPS, then decreased with time. Compared with group C, serum levels of TNF-α and IL-6 in group L were significantly higher than those in group C at each time point. Compared with group L, levels of TNF-α and IL-6 in group T were significantly lower at each time point. Compared with group L, the expression of HO-1 protein in group T was significantly higher, and increased more significantly with time. Compared with group L, the pathological changes of lung tissue in group T were significantly reduced at each time point.ConclusionsOur study demonstrates that pretreatment with rosiglitazone may protect against acute lung injury in septic rats through increasing the level of HO-1 protein in lung tissue and alleviating inflammatory response in sepsis rats.

rosiglitazone; sepsis; heme oxygenase-1; peroxisome proliferator activated receptor γ

210006江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)急診科

張錚，Email：Zz18351891108@126.com

R 459.7

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.09.006

2016-10-23)