王新月，馬 冬，張 琪，常凌雅，張麗杰，閆錫釗，王 洋，陳麗榮，陳允恩，李 鷗

王新月1，馬 冬1，張 琪1，常凌雅1，張麗杰1，閆錫釗1，王 洋1，陳麗榮2，陳允恩1，李 鷗3*

宮頸腫瘤；CD56；干擾素γ；預(yù)后

本研究背景：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年2月—2011年11月在唐山市工人醫(yī)院活檢或婦產(chǎn)科手術(shù)切除的宮頸炎、宮頸癌前病變及宮頸癌標(biāo)本共計(jì)121例，其中慢性宮頸炎患者25例(對照組)、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ級患者11例(CINⅠ組)、CINⅡ/Ⅲ級患者45例(CINⅡ/Ⅲ組)，宮頸鱗癌(SCC)患者40例(SCC組)。40例SCC患者中Ⅰ期17例，ⅡA期11例，ⅡB期12例。所有受試者術(shù)前未行化療、放療或生物治療。研究樣本的收集獲得患者知情同意。

1.2 隨訪 SCC組患者自病理確診之日起開始隨訪，治療后2年內(nèi)每3個(gè)月門診復(fù)查1次，3～5年內(nèi)每6個(gè)月門診復(fù)查1次，隨訪截至2015年12月，共計(jì)隨訪5年，平均隨訪時(shí)間33個(gè)月。若未就診于本院門診復(fù)查者，進(jìn)行電話隨訪，主要記錄癥狀、復(fù)查情況、復(fù)發(fā)情況、生存時(shí)間(月)及隨訪時(shí)狀態(tài)(存活、死亡或其他)等，患者因死亡或其他原因失聯(lián)，則停止對其隨訪。

1.3 主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)，自動脫水機(jī)、石蠟切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、烤片機(jī)(上海艾測電子科技有限公司)，正置顯微鏡(德國FLUKO公司)；單克隆抗人IFN-γ抗體(1∶50 dilution;R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國)，12+2高危型HPV聯(lián)合16/18基因分型檢測試劑盒(廣東凱普生物科技股份有限公司)。

1.5 HPV檢測 避開月經(jīng)期，24 h不上藥、不沖洗、無性生活。充分暴露宮頸外口，棉簽輕拭表面分泌物，將細(xì)胞刷尖端插入宮頸口，輕輕加壓并順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈[7]，細(xì)胞刷去除刷柄后放入專用的細(xì)胞保存液中，送病理科。HPV亞型檢出項(xiàng)包括：HPV16、18型和其他12種高危型(即HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)法測定不同病理宮頸組織中IFN-γ mRNA的表達(dá) Trizol試劑提取不同病理宮頸組織中的總RNA(Invitrogen公司)，根據(jù)其在波長260/280 nm處的吸光度值，對核酸進(jìn)行定量，采用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。所需引物序列設(shè)計(jì)來自Primer 5.0，引物合成由寶生物工程(大連)有限公司合成。IFN-γ：上游引物：5′-TATAGGTGGGTATAATGGGTTT-3′，下游引物：5′-ATCAAAACAATATACTACACCTCCT-3′；GAPDH：上游引物：5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-CGTTCTCAGCCTTGACGGT-3′。使用SYBR綠色?PCR Master Mix(應(yīng)用生物系統(tǒng))7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)評價(jià)IFN-γ mRNA表達(dá)。GAPDH作為內(nèi)參基因，以公式2-ΔΔCt(Ct為循環(huán)閾值)計(jì)算IFN-γ mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

注：CIN=宮頸上皮內(nèi)瘤變，SCC=宮頸鱗癌

2.2 HPV陽性與IFN-γ mRNA表達(dá)水平關(guān)系 4組HPV16陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4組HPV18、其他12種高危型陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。對照組HPV16陽性者IFN-γ mRNA表達(dá)低于HPV16陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)；CINⅠ組HPV16陽性與陰性者IFN-γ mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)；CINⅡ/Ⅲ和SCC組HPV16陽性者IFN-γ mRNA表達(dá)高于HPV16陰性者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表5、6，圖2)。

組別例數(shù)CD+56細(xì)胞百分比CD+56IFN?γ+細(xì)胞百分比對照組251 87±0 121 97±0 07CINⅠ組112 21±0 20a1 82±0 06CINⅡ/Ⅲ組453 15±0 14ab1 43±0 12abSCC組402 99±0 11abc0 86±0 18abcF值95 2379 92P值<0 001<0 001

注：CIN=宮頸上皮內(nèi)瘤變，SCC=宮頸鱗癌；與對照組比較，aP<0.05；與CINⅠ組比較，bP<0.05；與CINⅡ/Ⅲ組比較，cP<0.05

表2 4組HPV陽性率比較〔n(%)〕

注：HPV=人乳頭瘤病毒

Table3 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the control group

HPV16例數(shù)IFN?γmRNA陽性21 96±0 13陰性232 34±0 21t值2 491P值0 020

注：IFN-γ=γ干擾素

Table4 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the CINⅠ group

HPV16例數(shù)IFN?γmRNA陽性51 84±0 43陰性61 79±0 29t值0 230P值0 823

Table5 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the CINⅡ/Ⅲ group

HPV16例數(shù)IFN?γmRNA陽性291 66±0 11陰性161 21±0 16t值11 150P值<0 001

Table6 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the SCC group

HPV16例數(shù)IFN?γmRNA陽性290 89±0 12陰性110 56±0 09t值8 256P值<0 001

圖2 不同病理宮頸組織中IFN-γ mRNA表達(dá)

Figure2 Expression levels of IFN-γ mRNA in different cervical pathological tissues

基本特征例數(shù)高表達(dá)低表達(dá)χ2值P值年齡(歲)0 4520 501 ≤50278(29 6)19(70 4) >50136/137/13初次性生活年齡(歲)-0 350 ≤1611/10 >163913(33 3)26(66 7)流產(chǎn)次數(shù)(次)-1 000 ≤23813(34 2)25(65 8) >221/21/2HPV16陽性1 5010 221 是298(27 6)21(72 4) 否116/115/11貧血0 0020 965 是73/74/7 否3311(33 3)22(66 7)組織學(xué)分級3 1990 074 高分化75/72/7 中低分化339(27 3)24(72 7)腫瘤大小(cm)0 0630 802 ≤43513(37 1)22(62 9) >451/54/5宮旁浸潤3 8150 051 是121/1211/12 否2813(46 4)15(53 6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4 4260 035 有909/9 無3114(45 2)17(54 8)FIGO分期(期)7 3760 007 Ⅰ1710/177/17 Ⅱ234(17 4)19(82 6)

注：-采用Fisher確切概率法

圖3 SCC組患者宮頸組織中表達(dá)與預(yù)后生存率的關(guān)系

3 討論

作者貢獻(xiàn)：王新月進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果的分析與解釋及撰寫論文；張琪、常凌雅、張麗杰、閆錫釗、王洋、陳麗榮、陳允恩進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和整理；馬冬、李鷗進(jìn)行論文的修訂、文章的質(zhì)量控制及審校和對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

WANG Xin-yue1，MA Dong1，ZHANG Qi1，CHANG Ling-ya1，ZHANG Li-jie1，YAN Xi-zhao1，WANG Yang1，CHEN Li-rong2，CHEN Yun-en1，LI Ou3*

1.North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China 2.Qianxi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qianxi 063000，China 3.Tangshan Workers′ Hospital，Tangshan 063000，China

*Corresponding author：LI Ou，Professor；E-mail：tsliou@163.com

Uterine cervical neoplasms；CD56；Interferon-gamma；Prognosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81541149)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2016209046)

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.007

2017-01-24；

2017-06-15)

1.063000河北省唐山市，華北理工大學(xué)

2.063000河北省唐山市遷西縣中醫(yī)院

3.063000河北省唐山市，唐山工人醫(yī)院

*通信作者：李鷗，教授；E-mail：tsliou@163.com