黃 瑩 田德英 張振綱

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科（湖北 武漢，430030）

戊型肝炎病毒ORF3蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞中Ⅰ型干擾素及ISG15蛋白表達(dá)的影響*

黃 瑩 田德英 張振綱Δ

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科（湖北 武漢，430030）

目的：探討基因Ⅲ型戊型肝炎病毒（HEV）非結(jié)構(gòu)蛋白開放閱讀框3（ORF3）對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞中Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）及干擾素刺激基因（ISG）15蛋白表達(dá)的影響。方法：分別用基因Ⅲ型戊型肝炎病毒ORF3質(zhì)粒及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PLC/PRF/5細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染之后不同時(shí)間點(diǎn)（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h），用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中Ⅰ型干擾素的含量，并用Western blot方法檢測(cè)ISG15蛋白的表達(dá)。結(jié)果：ORF3組細(xì)胞上清液中IFN-α、β的水平均比空載組及空白組升高，而空載組與空白組之間無明顯改變。并且ORF3組細(xì)胞中ISG15蛋白的表達(dá)增加，而空載組與空白組無明顯改變。結(jié)論：基因Ⅲ型HEV的非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3促進(jìn)Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）及ISG15蛋白的表達(dá)。

肝炎，戊型，病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3；Ⅰ型干擾素；干擾素刺激基因15

戊型肝炎病毒（HEV）是世界范圍內(nèi)引起急性肝炎最常見的原因之一［1］，也是導(dǎo)致急性肝衰竭的原因之一。大多數(shù)情況下HEV感染具有自限性，但在免疫功能低下或免疫缺陷的人群中，HEV可能引起慢性感染［2－5］。然而目前HEV導(dǎo)致慢性化的機(jī)制仍不清楚。HEV是一含有3個(gè)開放閱讀框（ORF）全長約7.2kb的單股正鏈RNA病毒，ORF1編碼功能結(jié)構(gòu)域；ORF2編碼病毒衣殼；ORF3編碼一種涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病毒顆粒分泌的小分子磷酸化蛋白［6－9］。HEV分為4種基因型，基因Ⅰ型和Ⅱ型僅感染人類，而Ⅲ型和Ⅳ型具有人畜共患性。目前發(fā)現(xiàn)的慢性化病例主要是由基因Ⅲ型引起。病毒感染機(jī)體后引起機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)，分泌I型干擾素（IFN）抵御病毒的入侵。Ⅰ型IFN又能夠刺激干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)，其中ISG15的表達(dá)較明顯，研究發(fā)現(xiàn)ISG15蛋白能夠負(fù)性調(diào)控I型IFN的表達(dá)［10］。本研究通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ORF3質(zhì)粒到人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5中，探討HEV ORF3對(duì)Ⅰ型干擾素及其下游因子ISG15蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 兔抗人單克隆抗體ORF3（ABBIOTEC），鼠抗人單克隆抗體β-actin（武漢博士德），Lipofectamine2000（Invitrogen），胎牛血清，DMEN粉（Gibco），胞漿胞核蛋白提取試劑盒（PIERCE），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天），TEMED，丙烯酰胺（Amresco）。人干擾素ELISA試劑盒（上海西唐），無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（TIANGEN），空載質(zhì)粒pEGFP-N1及基因Ⅲ型pEGFP-ORF3由本實(shí)驗(yàn)室保存及構(gòu)建。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5由廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心提供。將細(xì)胞種植于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于5%的CO2，37℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取在對(duì)數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的PLC/PRF/5細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜。于轉(zhuǎn)染前2 h，換成無血清DMEM培養(yǎng)基。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，用100μlopti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒，并用槍頭輕輕混勻，室溫靜置5 min。取8μl的Lipofectamine2000稀釋在100μl opti-MEM中，室溫靜置5 min后，混合含Lipofectamine2000和質(zhì)粒的稀釋液（總體積為200μl），輕輕混勻并室溫靜置20 min。每個(gè)培養(yǎng)孔中加入混合液200μl，并前后輕輕晃動(dòng)六孔板，搖勻混合液后置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后，吸出混合液換入DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后于免疫熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒的表達(dá)情況，并于指定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ORF3蛋白及ISG15蛋白的表達(dá) 分別用胰酶消化按胞漿胞核蛋白提取試劑盒說明書提取胞漿蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制12%SDS-PAGE膠，每孔加入40μg蛋白樣品。先恒壓80V電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120v至溴酚藍(lán)到凝膠底部，此過程約用時(shí)1.5h。使用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為200mA 90min。用5%脫脂牛奶封閉過夜，一抗ORF3 1∶300，ISG15 1∶500，β-actin 1∶200室溫?fù)u床孵育2h，二抗1∶5000室溫?fù)u床孵育2h。用BandScan分析膠片灰度值。

1.2.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中Ⅰ型干擾素水平 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中Ⅰ型IFN水平，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 基因Ⅲ型HEV ORF3質(zhì)粒在PLC/PRF/5細(xì)胞中成功表達(dá)

將ORF3質(zhì)粒及空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PLC/PRF/5細(xì)胞中，通過Western blot法檢測(cè)HEV ORF3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示同空白組和空載組相比，轉(zhuǎn)染ORF3-GFP質(zhì)粒組細(xì)胞ORF3成功表達(dá) 見圖1。

圖1 基因Ⅲ型HEV ORF3質(zhì)粒在PLC/PRF/5細(xì)胞中成功表達(dá)圖

2.2 HEV ORF3蛋白對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞中Ⅰ型IFN的影響

通過ELISA試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后不同時(shí)間點(diǎn)（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h）細(xì)胞上清液中I型干擾素（IFN-α和IFN-β）的水平。結(jié)果顯示七個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ORF3組中細(xì)胞IFN-α和IFN-β的水平均較同一時(shí)間點(diǎn)空白組和空載組顯著增加（P＜0.05）。但同一時(shí)間點(diǎn)的空白組與空載組之間差異比較無明顯意義（P＞0.05）。并且可見ORF3組細(xì)胞上清液中IFN-α和IFN-β的水平均隨時(shí)間先升高后降低，即從0 h開始升高，在24 h達(dá)到最高水平，之后逐漸降低，見圖2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ORF3組細(xì)胞中IFN-α含量，可知轉(zhuǎn)染后8h、12h、24h、48h、72h等時(shí)間點(diǎn)均較0h和120h升高（均P＜0.05），且12h較8h、72h增高；48h較12h增高；24h較48h增高（均P＜0.05），但0h和120h兩者之間的IFN-α水平差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ORF3組細(xì)胞中IFN-β含量，可知轉(zhuǎn)染8h、12h、24h、48h、72h、120h等時(shí)間點(diǎn)均較0h升高（均P＜0.05），且12h、72h較8h、120h增高；24h、48h較12h、72h增高（均P＜0.05），但8h和120h、12h和72h、24h和48h兩兩之間IFN-β水平比較，差異細(xì)胞無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。但空白組和空載組細(xì)胞，IFN-α和IFN-β水平隨時(shí)間比較無明顯變化（P＞0.05）。

圖2 3組細(xì)胞I型IFN表達(dá)圖

表1 3組細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞上清液中IFN-α含量比較（±s，pg/ml）

表1 3組細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞上清液中IFN-α含量比較（±s，pg/ml）

IFN-α水平組別0h 8h 12h 24h 48h 72h 120h空白組（n＝6）8.196± 0.267 8.805± 2.022 9.302± 1.366 8.089± 1.054 9.397± 1.491 12.149± 0.610 14.172± 2.295空載組（n＝6）8.787± 1.364 7.111± 1.380 7.706± 1.396 8.368± 2.142 7.779± 1.581 13.084± 1.997 20.877± 0.938 11.958± 0.986 ORF3組（n＝6）20.908± 1.482 34.078± 1.277 41.855± 0.363 52.731± 0.813 46.756± 1.419 38.490± 2.734

表2 3組細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞上清液中IFN-β含量比較（±s，pg/ml）

表2 3組細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞上清液中IFN-β含量比較（±s，pg/ml）

IFN-α水平組別0h 8h 12h 24h 48h 72h 120h空白組（n＝6）24.229± 12.714± 2.350 14.232± 2.679 14.172± 2.1197.882空載組（n＝6）13.630± 2.548 14.425± 1.983 17.719± 5.003 23.370± 6.401 ORF3組（n＝6）12.555± 2.674 13.483± 1.988 12.946± 3.448 14.392± 0.879 13.789± 2.031 19.205± 3.999 58.389± 2.789 33.422± 3.914 54.170± 2.884 74.666± 1.425 82.396± 1.988 80.817± 2.452 70.202± 2.787

2.3 3組細(xì)胞中ISG15蛋白表達(dá)情況見圖3。 通過Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后不同時(shí)間點(diǎn)（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h）細(xì)胞中ISG15蛋白水平。結(jié)果顯示ORF3組細(xì)胞中ISG15蛋白含量在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24h、48h、72h、120h等時(shí)間點(diǎn)均較0h顯著增加（均P＜0.05），且在轉(zhuǎn)染后24h ISG15蛋白開始表達(dá)，直至72h達(dá)到最高水平，隨后下降。但空白組和空載組細(xì)胞中未見ISG15蛋白明顯表達(dá)。

圖3A 3組細(xì)胞中ISG15蛋白表達(dá)圖

圖3B ORF 3組細(xì)胞中ISG15蛋白表達(dá)半定量分析圖

3 討論

當(dāng)病毒、細(xì)菌等病原體侵入人體時(shí)，機(jī)體首先啟動(dòng)抗病原體天然免疫功能以抵抗病原體的入侵。而干擾素系統(tǒng)是宿主應(yīng)對(duì)病原體天然免疫反應(yīng)的重要組成部分。病原體中的病原相關(guān)分子模式（PAMP）同細(xì)胞中的模式識(shí)別受體（PRR）相結(jié)合，激活干擾素信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用［11，12］。而ISGs作為干擾素信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，對(duì)細(xì)胞抗病毒過程有影響。有研究將腎移植后合并HEV感染者和無HEV感染者血清進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)包括ISG15在內(nèi)的25個(gè)ISGs水平上調(diào)［13］。干擾素系統(tǒng)主要通過IFN-α和IFN-β信號(hào)通路發(fā)揮主要作用［14］。HEVORF3蛋白可以通過阻斷干擾素信號(hào)通路的信號(hào)因子STAT1的磷酸化而下調(diào)IFN-α的表達(dá)，以逃避免疫應(yīng)答，從而引起細(xì)胞中病毒的持續(xù)存在［8］。與此同時(shí)，HEV ORF3蛋白可以通過上調(diào)RIG-I的量來增強(qiáng)誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生［15］。這意味著HEV可以通過ORF3蛋白發(fā)揮雙重相反的作用［7］。目前HEV ORF3蛋白在HEV感染中的明確作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)HEV ORF3蛋白可在細(xì)胞中誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的表達(dá)，且Ⅰ型IFN的表達(dá)先增加后降低，但總體表達(dá)量是增加的。因作為PAMP的HEV ORF3蛋白可以通過與PRR（RIG-I和TLR3）結(jié)合，激活干擾素信號(hào)通路［16，17］。而干擾素信號(hào)通路的激活促進(jìn)了下游因子ISG15蛋白的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)ISG15蛋白在體內(nèi)干擾素免疫中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［10，14］。另有研究發(fā)現(xiàn)ISG15蛋白能夠促進(jìn)丙型肝炎病毒（HCV）的復(fù)制，并且能夠抑制IFN-α的抗病毒作用［18，19］。故推測(cè)ISG15蛋白可能在HEV病毒感染發(fā)生慢性化過程中發(fā)揮重要的作用，但目前ISG15蛋白對(duì)HEV感染的影響尚無研究。本研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染ORF3質(zhì)粒的細(xì)胞中Ⅰ型IFN的表達(dá)呈先增加后降低的趨勢(shì)，并且在24小時(shí)的表達(dá)量達(dá)到最高水平，隨后開始下降，同時(shí)ISG15蛋白在24小時(shí)開始表達(dá)，之后表達(dá)量逐漸增加，那么，ISG15蛋白是否對(duì)Ⅰ型IFN的減少發(fā)揮直接作用，從而減弱機(jī)體抗病毒能力，引起HEV持續(xù)存在，最終導(dǎo)致HEV發(fā)生慢性感染，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來明確。ISG15蛋白是否對(duì)Ⅰ型IFN發(fā)揮直接負(fù)性調(diào)控作用并對(duì)病毒感染存在確切影響，這也需要做進(jìn)一步的研究。

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Open reading frame 3 protein of hepatitis E virus regulates typeⅠinterferon and ISG15 protein induction in Human hepatocellular carcinoma cells

HUANGYing，TIAN De-ying，ZHANG Zhen-gangΔ.Department of Infectious Diseases，TongJi Hospital，TongJi Medical College，Huazhong University of Science and Technology（Wuhan Hubei，430030）China

Objective：To study the effect of genotype 3 hepatitis E virus ORF3 protein onthe production of typeⅠinterferon and ISG15 protein in Human hepatocellular carcinoma cells.M ethods：Hepatocellular carcinoma cell line PLC－PRF－5 was respectively transfected with the genotype III hepatitis E virus ORF3 plasmid and the empty plasmid.At different time points after transfection（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h），the production of IFNⅠin supernatantswasmeasured by ELISA and the expression of ISG15 protein was assayed byWestern blot.Results：The levels of IFNαandβin the ORF3 plasmid groupsupernatant were obviously higher than those in the empty plasmid group and blank group，but therewas no significant change in the empty plasmid group and blank group.And the expression of ISG15 protein was increased in ORF3 plasmid group，but there was no significant change in the empty plasmid group and blank group.Conclusion：GenotypeⅢHEV ORF3 protein promotes the expression of type I interferon（IFNαand IFNβ）and ISG15 protein.

Hepatitis E virus；ORF3；Interferon-I；ISG15

，2017－04－28 編輯：程良斌）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.013

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81570540），湖北省衛(wèi)生計(jì)生科研基金項(xiàng)目（No.WJ2015MA002）；Δ通訊作者，E－mail：zhangzhg＠126.com