鄢明輝

(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心， 上海 200436)

腸膜明串珠菌BD3749亞種水平的鑒定及其生長(zhǎng)特性研究

鄢明輝

(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心， 上海 200436)

對(duì)腸膜明串珠菌BD3749進(jìn)行亞種水平的鑒定，探索其在食品工業(yè)中的應(yīng)用前景。利用分子生物學(xué)及生化鑒定的手段對(duì)高產(chǎn)胞外多糖的腸膜明串珠菌BD3749進(jìn)行了亞種水平上的鑒定；通過測(cè)定其在番茄汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過程的OD595、pH值動(dòng)態(tài)變化以及對(duì)其中蔗糖的利用來評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)狀況；通過對(duì)其生長(zhǎng)過程中的胞外多糖產(chǎn)量的分析評(píng)價(jià)其發(fā)酵產(chǎn)物作為膳食補(bǔ)充劑的潛力；使用不同裝液量培養(yǎng)模擬不同的氧壓力強(qiáng)度，研究氧脅迫強(qiáng)度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響，并據(jù)此對(duì)其產(chǎn)胞外多糖的條件進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)鑒定BD3749為腸膜明串珠菌腸膜亞種，屬于食品中可以使用的菌株。在此基礎(chǔ)上研究了該菌株在番茄汁中的發(fā)酵及產(chǎn)胞外多糖性能，BD3749在番茄汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，其合成的胞外多糖主要為不溶性多糖。通過不同裝液量發(fā)酵實(shí)驗(yàn)考察了通氧量對(duì)BD3749不溶性多糖產(chǎn)量的影響，并對(duì)BD3749在番茄汁培養(yǎng)基中的產(chǎn)多糖量進(jìn)行了初步優(yōu)化，在優(yōu)化條件下，不溶性多糖的產(chǎn)量可達(dá)14.5 g/L。BD3749屬于食品中可以使用的腸膜明串珠菌腸膜亞種，其能以番茄汁為基質(zhì)生長(zhǎng)并合成大量胞外多糖，在食品工業(yè)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

腸膜明串珠菌； 胞外多糖； 亞種鑒定； 番茄汁； 不溶性多糖； 膳食補(bǔ)充劑

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是一類重要的乳酸菌[1-2]，因其優(yōu)良的發(fā)酵性能以及能夠產(chǎn)生特殊風(fēng)味物質(zhì)的特性[3]在食品中得到廣泛應(yīng)用[4-8]。在乳品工業(yè)領(lǐng)域，腸膜明串珠菌也是一種重要的發(fā)酵劑，例如，腸膜明串珠菌在奶酪成熟過程中發(fā)揮重要作用，并且為奶酪貢獻(xiàn)了特殊風(fēng)味[3, 5]。此外，腸膜明串珠菌在其他類型的乳制品中的應(yīng)用也日漸成熟[5, 9-10]。

腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)是腸膜明串珠菌的一個(gè)亞種，被我國(guó)衛(wèi)生部(衛(wèi)生部公告2012年第8號(hào))與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)列為安全可食用菌種之一[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離到一株高產(chǎn)胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)的腸膜明串珠菌BD3749(CGMCC10064)，初步研究表明，其EPS受環(huán)境中氧的調(diào)控[12]，在優(yōu)化條件下其產(chǎn)量可達(dá)31 g/L。與此前分離到的腸膜明串珠菌菌株不同[2, 5, 13]，該菌株特異性地合成不溶性EPS并介導(dǎo)形成由菌體、EPS及其他胞外物組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)[12]。BD3749合成的EPS結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到初步解析，主要為高分子量葡聚糖[12, 14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，該葡聚糖不被人體消化吸收，但能特異性地促進(jìn)某些有益菌的增殖，因而有望作為新型的、具有益生特性的膳食補(bǔ)充劑[15-16]。

番茄汁作為一種低成本的培養(yǎng)基在科研及食品工業(yè)領(lǐng)域得到越來越多的重視。其具有來源廣泛、成本低廉、天然安全等特點(diǎn)；同時(shí)富含多種維生素及膳食纖維，更有番茄紅素等抗氧化成分。因此，隨著研究的深入，以番茄汁為基礎(chǔ)介質(zhì)的食品形式不斷豐富[17-20]。這些產(chǎn)品在降低物料成本的同時(shí)，提高了食品的安全性，并有利于產(chǎn)品及其品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的成本控制。此前的研究表明，一些明串珠菌菌株在番茄汁培養(yǎng)基中能夠?qū)崿F(xiàn)良好生長(zhǎng)，并且當(dāng)蔗糖充足時(shí)能夠產(chǎn)生大量EPS[13, 21]。因此，我們期望利用BD3749產(chǎn)生大量EPS的特征來研制一類基于番茄汁介質(zhì)的食品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：腸膜明串珠菌BD3749(中國(guó)普通微生物菌種保藏中心編號(hào)CGMCC10064)由乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉10 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1g，K2HPO42 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸三銨2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， MnSO4·4H2O 0.05 g，蒸餾水定容至1 L。

番茄汁培養(yǎng)基：由市場(chǎng)購(gòu)得新鮮番茄，榨汁后，將所得液體過濾煮沸，離心取上清液，加入蔗糖，使得ρ(蔗糖)=50 g/L，加熱溶解后冷卻，調(diào)節(jié)pH值至6.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

收集BD3749菌體，使用試劑盒Tiangen抽提基因組DNA作為后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的模板。分別使用引物27-F和1492-R、gyrB-F和gyrB-R，如表1，進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送樣測(cè)序。

表1 PCR反應(yīng)中所用到的引物

1.2.2序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建

上述PCR產(chǎn)物測(cè)得序列使用NCBI 網(wǎng)站BLASTn工具進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果使用MEGA 6.0進(jìn)行序列比對(duì)并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建進(jìn)化樹[24]。進(jìn)化樹的構(gòu)建參考之前的研究[12]，使用JTT matrix-based模型、采用最大似然法構(gòu)建。

1.2.3核苷酸序列

BD3749的16S rDNA序列已提交至Genbank，登記號(hào)為KU207096.1。BD3749的基因組數(shù)據(jù)來源于Genbank(登記號(hào)CP014610.1)，進(jìn)化分析中所用到的其他腸膜明串珠菌的基因組信息均來源于Genbank：DSM20484(CP012009.1)、KFRI-MG(CP000574.1)、ATCC8293(CP000414.1)、DRC0211(CP013016.1)、J18(CP003101.3)、DSM20241(CP015247.1)。

1.2.4API 50CH生化鑒定

利用bioMe′ rieux API的50CH鑒定系統(tǒng)測(cè)定菌株BD3749發(fā)酵碳水化合物的產(chǎn)酸情況；同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8293的發(fā)酵情況并將兩者的結(jié)果進(jìn)行比較。操作按照廠商的說明書進(jìn)行，受試菌株BD3749及ATCC8293為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物，設(shè)置OD600=0.4～0.6。

1.2.5生長(zhǎng)曲線及活菌數(shù)測(cè)定

將MRS中培養(yǎng)過夜的BD3749種子液按1∶50的質(zhì)量比例轉(zhuǎn)接于新鮮的番茄汁培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中160 r/min振蕩培養(yǎng)。按設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定OD595，根據(jù)OD值變化繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)樣品經(jīng)梯度稀釋后均勻涂布于MRS平板(每個(gè)樣品做3次重復(fù))，置于厭氧箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，通過所得的活菌數(shù)量繪制活菌數(shù)變化曲線。

1.2.6發(fā)酵過程中產(chǎn)EPS量分析

對(duì)BD3749發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)EPS樣品的制備方法參考之前的研究[12-13]，具體地，對(duì)可溶性多糖的測(cè)定，將發(fā)酵液以8 000 r/min離心10 min，取上清，緩慢加入3倍體積的無水酒精(邊攪拌邊加入)，4 ℃靜置2 h后1.5×104r/min離心10 min，收集所得沉淀，經(jīng)冷凍干燥后稱重即得可溶性胞外多糖(soluble EPS,sEPS)的量；而對(duì)于不溶性胞外多糖(insoluble EPS, iEPS)，將發(fā)酵液凍干后，將凍干粉末與2 mol/L的NaOH溶液以1 g∶4 mL的比例混合室溫浸提2 h，1.5×104r/min離心10 min，取上清，用2.5 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，1.5×104r/min離心10 min取沉淀，冷凍干燥后稱重即得水不溶性胞外多糖的量。發(fā)酵液中殘留的蔗糖的量由上海必諾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司以高效液相色譜的方法進(jìn)行測(cè)定；發(fā)酵過程中的pH值使用德國(guó)Sartorius公司PB- 100型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7不同裝液量對(duì)產(chǎn)EPS量的影響分析

使用250 mL錐形瓶，預(yù)裝入不同體積的番茄汁培養(yǎng)基：10，20，40，80，100，200 mL。將BD3749種子液按1∶50的質(zhì)量比接種于上述培養(yǎng)體系中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后收取發(fā)酵液，按1.2.6節(jié)方法對(duì)產(chǎn)糖量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1BD3749產(chǎn)EPS特性及16SrDNA序列分析

BD3749在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中合成大量EPS[25]，發(fā)酵24 h形成拉絲性能良好的黏稠狀產(chǎn)物。其在

MRS+蔗糖平板上形成包裹菌落的黏性EPS包被，見圖1。對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)物的分析表明，其中包含大量不溶性EPS及水溶性EPS。對(duì)腸膜明串珠菌BD3749依據(jù)16S rDNA序列進(jìn)行進(jìn)化分析，如圖2。

箭頭位置是BD3749在MRS+蔗糖平板上形成包裹菌落的黏性EPS包被。圖1 腸膜明串珠菌BD3749的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of L. mesenteroides BD3749

圖2 腸膜明串珠菌BD3749依據(jù)16S rDNA序列的進(jìn)化分析Fig.2 16S rDNA-based phylogeny analysis of L. mesenteroides BD3749

2.2 BD3749亞種歸屬

2.2.1基于分子生物學(xué)的亞種水平鑒定

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，BD3749的基因組序列也已經(jīng)公布。對(duì)BD3749的全基因組序列(CP014610.1)和已知的腸膜明串珠菌基因組信息進(jìn)行的分析表明，其在基因組水平上與已鑒定的腸膜明串珠菌腸膜亞種菌株有很高的相似性(基因組水平上的相似性高達(dá)92%以上)。進(jìn)一步利用MEGA 6.0對(duì)已知的腸膜明串珠菌4個(gè)亞種(腸膜亞種subsp.mesenteroides、右旋糖苷亞種subsp.dextranicum、suionicum亞種subsp.suionicum[26]和乳脂亞種subsp.cremoris)的基因組序列進(jìn)行了進(jìn)化分析，結(jié)果見圖3。BD3749與已知的腸膜明串珠菌腸膜亞種聚為一類，如標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8293。此外，根據(jù)高彩霞等[11]建立的腸膜明串珠菌的亞種水平上的鑒定方法，對(duì)BD3749的gyrB基因進(jìn)行序列分析結(jié)果也表明其為腸膜亞種，見圖4。

2.2.2基于傳統(tǒng)生化方法的鑒定

雖然基于分子生物學(xué)技術(shù)的菌種鑒定已經(jīng)得到廣泛使用，但傳統(tǒng)的生化鑒定方法依然是菌種鑒定中的重要標(biāo)準(zhǔn)[2, 27-29]。在上述分子水平的鑒定基礎(chǔ)上，我們使用API 50CH鑒定系統(tǒng)，對(duì)BD3749不同碳源的發(fā)酵特性進(jìn)行了分析，結(jié)果見表2。并同時(shí)將其與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8293的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明BD3749對(duì)不同碳源的利用及發(fā)酵特性與ATCC8293高度相似，進(jìn)而從生化水平上確證BD3749為腸膜明串珠菌腸膜亞種[1, 30-31]。根據(jù)美國(guó)FDA及我國(guó)衛(wèi)生部批文的規(guī)定，該菌株屬于可以應(yīng)用于食品中的菌株。

2.3 BD3749在番茄汁中的生長(zhǎng)及產(chǎn)EPS情況

已有研究表明，腸膜明串珠菌合成的EPS主要為右旋糖苷dextran[5, 13, 32]，該類EPS能夠有效改善食品的質(zhì)構(gòu)及穩(wěn)定性能[33]。而BD3749在產(chǎn)EPS方面與已報(bào)道的腸膜明串珠菌不同的，除了水溶性的EPS，其還能產(chǎn)生不溶性的EPS[12-13]。對(duì)BD3749的不溶性多糖的研究表明，其主要為不溶性的葡聚糖，能夠?qū)е嘛柛垢星也槐蝗梭w消化吸收，有望作為無熱量的膳食補(bǔ)充劑[14, 16]，在熱量攝入過高導(dǎo)致的代謝性疾病普遍發(fā)生的當(dāng)下，可對(duì)諸如糖尿病之類的慢性疾病起到干預(yù)作用。因此，能夠產(chǎn)生該類EPS的腸膜明串珠菌作為發(fā)酵劑應(yīng)用于食品工業(yè)，一方面有望通過產(chǎn)生EPS來改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性來減少或者避免各種食品添加劑的使用；另一方面則可以利用其EPS作為膳食補(bǔ)充劑的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)一些代謝疾病的干預(yù)。為了探索BD3749在食品中的應(yīng)用前景，參考之前的研究[13, 15]對(duì)其在番茄汁中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了研究。

灰色區(qū)域所示為腸膜亞種。圖3 基于基因組序列的進(jìn)化分析Fig.3 Phylogeny analysis based on genome sequences.

圖4 基于gyrB基因序列的進(jìn)化分析Fig.4 Phylogeny analysis based on sequence of gyrB

碳水化合物產(chǎn)酸情況對(duì)照-甘露醇+赤蘚醇-D?阿拉伯糖-L?阿拉伯糖+D?核糖-D?木糖-L?木糖-阿東醇-海藻糖+D?半乳糖+D?葡萄糖+D?果糖+D?甘露糖+L?山梨糖-L?鼠李糖-衛(wèi)矛醇-肌醇-菊糖-山梨醇-甘油-麥芽糖+N?乙酰?葡糖胺+苦杏仁甙-碳水化合物產(chǎn)酸情況熊果甙-七葉靈+β?甲基?D?木糖甙-α?甲基?D?葡萄糖+α?甲基?D?甘露糖-2?酮基?葡萄糖酸鹽-蜜二糖+木糖醇-棉子糖+松三糖-乳糖+淀粉-糖原-水楊苷+龍膽二糖-D?來蘇糖-D?塔格糖-D?巖藻糖-L?巖藻糖-D?阿拉伯糖醇-L?阿拉伯糖醇-葡萄糖酸鹽-纖維二糖-D?松二糖+

“+”表示產(chǎn)酸，“-”表示不產(chǎn)酸。

2.3.1BD3749在番茄汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線

對(duì)BD3749在番茄汁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線測(cè)定，見圖5。BD3749在ρ(蔗糖)=50 g/L的番茄汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，發(fā)酵24 h后生物量明顯增加，且發(fā)酵液pH值顯著降低。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)(至72 h)，生物量逐漸增加，伴隨發(fā)酵液pH值不斷降低。

圖5 BD3749在含蔗糖的番茄汁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth characteristic of BD3749 in tomato juice supplemented with sucrose

2.3.2BD3749在番茄汁培養(yǎng)基中產(chǎn)EPS情況

腸膜明串珠菌合成的EPS在食品工業(yè)中有良好的應(yīng)用前景，因此，我們對(duì)BD3749在番茄汁培養(yǎng)基中的產(chǎn)EPS情況進(jìn)行了分析，見圖6，BD3749利用蔗糖在番茄汁培養(yǎng)基中合成大量EPS，其中主要為不溶性多糖(iEPS)。不溶性多糖的產(chǎn)量最高可達(dá)14.5 g/L(發(fā)酵48 h)，相比之下，可溶性多糖(sEPS)則相對(duì)較低，在發(fā)酵48 h后可達(dá)約6 g/L。值得注意的是，iEPS的產(chǎn)量在48h以后略有下降，推測(cè)可能是BD3749中存在能對(duì)其進(jìn)行分解利用的酶(系)。

圖6 BD3749在含蔗糖的番茄汁培養(yǎng)基中的產(chǎn)EPS情況Fig.6 EPS produced by BD3749 in tomato juice supplemented with sucrose

2.3.3不同通氧量對(duì)BD3749產(chǎn)EPS的影響

腸膜明串珠菌為過氧化氫酶陰性的兼性厭氧菌，不同濃度的氧氣可能對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。此外，之前的研究表明，BD3749負(fù)責(zé)EPS合成的酶會(huì)受通氧量的調(diào)控[12]。因此，我們進(jìn)一步研究了不同裝液量對(duì)BD3749產(chǎn)EPS量的影響，見圖7。

圖7 BD3749在不同裝液量體系中產(chǎn)EPS情況Fig.7 EPS synthesis of BD3749 in container filled with different volume of tomato juice medium

由圖7可知，在相同容器、不同裝液量(模擬不同的通氧量)的培養(yǎng)體系中，BD3749的不溶性多糖(iEPS)產(chǎn)量也發(fā)生變化。在裝液量較少的情況下，iEPS產(chǎn)量會(huì)隨著裝液量的增加而增加，在80 mL裝液量時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，為14.5 g/L；而裝液量超過80 mL時(shí)，單位體積的產(chǎn)糖量會(huì)隨著裝液量的增多而降低。與此不同的是，水溶性多糖(sEPS)的產(chǎn)量也沒有明顯的變化，這與此前在合成培養(yǎng)基中的結(jié)果相似[12]。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)腸膜明串珠菌BD3749進(jìn)行了亞種水平上的鑒定，并對(duì)其在食品中的應(yīng)用做了探索。通過分子生物學(xué)及生物化學(xué)手段確定了BD3749屬于食品中可以使用的腸膜明串珠菌腸膜亞種，在此基礎(chǔ)上研究了其在番茄汁培養(yǎng)基中的發(fā)酵及產(chǎn)EPS性能。進(jìn)一步考察了通氧量對(duì)BD3749不溶性多糖產(chǎn)量的影響，并對(duì)BD3749在番茄汁培養(yǎng)基中的產(chǎn)EPS量進(jìn)行了初步優(yōu)化，在優(yōu)化的裝液量條件下，iEPS的產(chǎn)量可達(dá)14.5 g/L。該條件下合成的iEPS有望作為膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用于食品中，對(duì)因能量過剩而引發(fā)的代謝性疾病進(jìn)行飲食干預(yù)。

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(責(zé)任編輯：李 寧)

SubspeciesDeterminationofLeuconostocmesenteroidesBD3749andItsGrowthCharacteristics

YAN Minghui

(StateKeyLaboratoryofDairyBiotechnology/ShanghaiEngineeringResearchCenterofDairyBiotechnology,DairyResearchInstituteofBrightDairyandFoodCoLtd,Shanghai200436,China)

To identifyLeuconostocmesenteroidesBD3749 at the subspecies level and to explore the application prospect of this strain in food industry, BD3749 was identified at the subspecies level by molecular biology and biochemistry techniques. The growth of BD3749 in tomato juice supplemented with sucrose was investigated through dynamic monitoring of OD595and pH as well as the remnant amount of sucrose. The productivity of exopolysaccharide (EPS) was determined to evaluate the potential of BD3749 to serve as dietary supplement. The effect of oxygen stress on the amount of EPS was analyzed and the growth condition was optimized accordingly for EPS production. BD3749 was assigned to beL.mesenteroidessubsp.mesenteroidesbased on these studies. Furthermore, BD3749 grew well in tomato juice supplemented with sucrose, and EPS produced was mainly insoluble EPS (iEPS). Subsequently, the effect of oxygen on EPS production was analyzed and the condition was optimized accordingly for EPS production. In the optimized content of oxygen, 14.5 g/L iEPS was achieved after 48h fermentation. BD3749 is a strain ofL.mesenteroidessubsp.mesenteroides, which is generally regarded as safe and can be applied in food industry. With the excellent fermentation performance, BD3749 is a strain of high potential in food industry.

Leuconostocmesenteroides; exopolysaccharide; subspecies determination; tomato juice; iEPS; dietary supplement

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.04.006

2095-6002(2017)04-0042-07

鄢明輝. 腸膜明串珠菌BD3749亞種水平的鑒定及其生長(zhǎng)特性研究[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(4):42-48. YAN Minghui. Subspecies determination ofLeuconostocmesenteroidesBD3749 and its growth characteristics [J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(4):42-48.

2017-05-11

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD18B01)。

鄢明輝，男，博士，主要從事食品微生物學(xué)方面的研究。

TS252.1； TS252.54； Q934

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