李南南， 黎 妮， 曹艷花， 張 欣， 肖 明，劉 洋,*， 王偉平,4,*

(1.湖南雜交水稻研究中心 雜交水稻國家重點實驗室， 湖南 長沙 410125；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心， 北京 100015；3.上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院， 上海 200234；4.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖南 長沙 410128)

3個雜交水稻親本成熟期種子內(nèi)生細菌多樣性研究

李南南1,2,3， 黎 妮1， 曹艷花2， 張 欣2， 肖 明3,*，劉 洋2,*， 王偉平1,4,*

(1.湖南雜交水稻研究中心 雜交水稻國家重點實驗室， 湖南 長沙 410125；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心， 北京 100015；3.上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院， 上海 200234；4.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖南 長沙 410128)

通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，對成熟期的雜交水稻親本“深08S”、“和620S”及“16A007”種子內(nèi)生細菌群落結構多樣性進行分析。實驗表明，處于成熟期的雜交水稻親本種子內(nèi)生細菌群落結構具有多樣性?！吧?8S”種子內(nèi)生細菌含40個分類操作單元(operational taxonomic units， OTU)，分屬Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Bacteroidetes類群，其中，第一優(yōu)勢菌屬為Rhizobium，豐度為15.83%，第二優(yōu)勢菌屬為Bacillus，第三優(yōu)勢菌屬為Sphingomonas和Curtobacterium?！昂?20S”種子內(nèi)生細菌含20個OTU，分屬Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria類群，其中，第一優(yōu)勢菌屬為Curtobacterium，豐度為25.33%，第二和第三優(yōu)勢菌屬分別為Microbacterium和Pantoea。“16A007”種子內(nèi)生細菌含24個OTU，分屬Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria類群，其中，第一優(yōu)勢菌屬為Pantoea，豐度為35.00%，第二優(yōu)勢菌屬和第三優(yōu)勢菌屬分別為Micrococcus和Pseudomonas。相比處于灌漿期的水稻種子內(nèi)生細菌，成熟期的水稻種子內(nèi)生細菌更豐富，種類更多。由研究可見，種子內(nèi)生細菌的種類隨種子成熟度而變化，成熟期的水稻種子具有豐富的內(nèi)生菌資源，可為開發(fā)新的植物益生菌劑奠定基礎，且水稻種子內(nèi)生細菌的組成與水稻品種有一定的關系。

雜交水稻親本； 成熟期； 種子內(nèi)生細菌； 可培養(yǎng)方法； 群落多樣性

植物內(nèi)生細菌是十分重要的內(nèi)生菌資源，能在健康植物組織內(nèi)定殖，通過多種作用影響植物生長和發(fā)育，與植物建立和諧聯(lián)合關系[1]，其中對植物的直接促生作用包括產(chǎn)吲哚-3-乙酸(IAA)、赤霉素及細胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)促進植物生長發(fā)育[2-3]及生物固氮等；對植物的間接促生作用主要是植物內(nèi)生細菌的生防作用包括通過分泌抗生物質(zhì)、競爭生態(tài)位及競爭營養(yǎng)物質(zhì)等起到生防作用[4-5]；誘導植物系統(tǒng)抗性(induce systematic resis-tance, ISR)來提高宿主植物抗病害能力[6]。隨著植物微生態(tài)學的深入研究，人們逐步認識到植物內(nèi)生細菌的重要有益生物學作用。大量實驗證實植物種子的表面及內(nèi)部均有豐富的微生物群落[7]。目前，已報道的植物內(nèi)生細菌分屬54個屬，已超過129 種，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[8]。

水稻是世界三大糧食作物之一，我國水稻種植面積居世界第二位，對國家的糧食安全和國民經(jīng)濟起著舉足輕重的作用。研究表明，水稻中的內(nèi)生菌能夠?qū)λ镜纳L起到直接或間接促進作用[9-14]。目前，與植物相聯(lián)合細菌的研究報道越來越多，但主要集中于根和根際內(nèi)生菌的研究，對與種子聯(lián)合的內(nèi)生菌的研究還相對較少[15-18]。國內(nèi)外對水稻的研究主要集中于不同品種水稻內(nèi)生菌與品系之間關系[19]及內(nèi)生菌與宿主植物或根際土壤微生物的作用[20]，而有關水稻不同生長期的水稻植株內(nèi)生菌群落結構的多態(tài)性研究報道甚少，尤其是有關水稻種子內(nèi)生菌群落結構的多態(tài)性研究報道更少。本課題組曾采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，對處于灌漿期的雜交水稻親本“深08S”、“和620S”及“16A007”種子內(nèi)生細菌群落結構多樣性進行了研究，獲得了一批內(nèi)生細菌及優(yōu)勢菌屬。本研究以成熟期的相同水稻親本“深08S”、“和620S”及“16A007”種子為研究對象，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對其內(nèi)生細菌群落結構多樣性進行研究，以獲得豐富的水稻種子內(nèi)生細菌資源，為篩選生防促生作用明顯、拮抗譜較廣且定殖能力良好的有益細菌奠定基礎，同時揭示內(nèi)生細菌群落結構的多態(tài)性，進一步了解種子內(nèi)生細菌群落結構與水稻生長發(fā)育的關系，為深入探討內(nèi)生細菌與水稻的相互作用機制和發(fā)掘植物益生內(nèi)生菌奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1水稻種子的采集

樣品為湖南雜交水稻研究中心提供的雜交水稻兩系不育系親本“深08S”、“和620S”及恢復系親本“16A007”種子，取材時期為成熟期(2016年4月18日)，采自湖南雜交水稻研究中心海南南繁試驗基地，4 ℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑

LA、TSA和NA成品培養(yǎng)基，購于北京陸橋公司；細菌基因組DNA提取試劑盒及PCR相關試劑購于TIANGEN公司；PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品表面滅菌

先用無菌水清洗水稻種子，待種子晾干后，依次用70%乙醇浸泡3 min，次氯酸鈉溶液(2.5%有效Cl-)浸泡5 min，70%乙醇浸泡30 s，最后用無菌水淋洗5次，在無菌條件下晾干；取最后一次淋洗水120 μL涂于LB平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，檢測表面滅菌效果。表面滅菌徹底的種子用于實驗。

1.2.2內(nèi)生細菌的分離與純化

水稻種子內(nèi)生細菌群落多樣性研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術。取5.0 g表面滅菌徹底的水稻種子用無菌研缽研磨成粉末，采用梯度稀釋法制備稀釋倍數(shù)為1×10-2到1×10-4的系列稀釋液。每一梯度稀釋液分別取100 μL涂布于TSA、LA、NA平板上，每個處理組設置3個平行，30 ℃培養(yǎng)3天后根據(jù)平板上菌落的形態(tài)(表面光澤度、透明度、大小、顏色、形狀、邊緣整齊度等)隨機挑取具有代表性單菌落，純化后4 ℃保存?zhèn)溆茫瑫r保存于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)。

1.2.3內(nèi)生細菌的16S rDNA序列分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。用正向引物27F(5′-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌16S rDNA。PCR反應體系(50 μL)：DNA模板3 μL、10×buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、Taq酶(5 U/L)0.25 μL、引物27F(10 mmol/L)1 μL、引物1492R(10 mmol/L)1 μL，最后用ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用ABI 3730型DNA測序儀進行測序(ABI，USA)。將測序得到的結果在EzTaxon server 2.1進行比對，確定與已知序列同源關系，經(jīng)比對序列相似性達到98.65% 以上歸為同一個種[21]。

2 結果與分析

利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從成熟期的雜交水稻親本“深08S”、“和620S”及“16A007”種子中分別挑取120、75和100株細菌，分別有40，20和24個代表菌株(見表1至表3)。將代表菌株序列信息提交到GenBank，登錄號為KX212108～KX212189。

表1 雜交水稻不育系“深08S”種子內(nèi)生細菌分布

表2 雜交水稻不育系“和620S”種子內(nèi)生細菌分布

對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，成熟水稻種子內(nèi)生細菌群落具有多樣性，見表4。由表1和表4可知，“深08S”種子內(nèi)生細菌群落分屬4個類群Proteobacteria類群(63個克隆，52.52%)、Actinobacteria(33個克隆，27.50%)、Firmicutes(23個克隆，19.15%)及Bacteroidetes(1個克隆，0.83%)，其中Proteobacteria包含19個OTU，Actinobacteria包含9個OTU，F(xiàn)irmicutes包含11個OTU，Bacteroidetes包含1個OTU。該群落分屬22個屬，優(yōu)勢屬(豐度)為Rhizobium(15.83%)、Bacillus(14.99%)、Sphingomonas(9.17%)及Curtobacterium(9.17%)。由表2和表4可知，“和620S”種子內(nèi)生細菌群落分屬3個類群Proteobacteria類群(40個克隆，53.34%)、Actinobacteria(31個克隆，41.32%)及Firmicutes(4個克隆，5.34%)，其中Proteobacteria包含12個OTU，Actinobacteria包含6個OTU，F(xiàn)irmicutes包含2個OTU。該群落分屬12個屬，優(yōu)勢屬(豐度)為Curtobacterium(25.33%)、Microbacterium(15.99%)及Pantoea(11.99%)。由表3和表4可知，“16A007”種子內(nèi)生細菌群落屬3個類群Proteobacteria類群(71個克隆，71.00%)、Actinobacteria(25個克隆，25.00%)及Firmicutes(4個克隆，4.00%)，其中Proteobacteria包含14個OTU，Actinobacteria包含6個OTU，F(xiàn)irmicutes包含4個OTU，Bacteroidetes包含1個OTU。該群落分屬14個屬，優(yōu)勢屬為Pantoea(35.00%)、Micrococcus(11.00%)及Pseudomonas(8.00%)。

“深08S”、“和620S”和“16A007”成熟種子有共同的內(nèi)生菌屬，如Rhizobium是“深08S”的第一優(yōu)勢菌屬，也是“和620S”和“16A007”的并列第四優(yōu)勢菌屬；Curtobacterium是“和620S”的第一優(yōu)勢菌屬，是“深08S”的并列第三優(yōu)勢菌屬，也是“16A007”的并列第四優(yōu)勢菌屬；Pantoea是“16A007”的第一優(yōu)勢菌屬，是“和620S”的第三優(yōu)勢菌屬，也是“深08S”的并列第四優(yōu)勢菌屬。除Rhizobium、Curtobacterium和Pantoea外3個水稻親本種子也有其他共同內(nèi)生菌屬，如Bacillus、Sphingomonas、Microbacterium、Pseudomonas、Xanthomonas等。而Novosphingobium、Sphingobacterium、Acidovorax、Kytococcus、Kocuria、Escherichia菌屬只從“深08S”成熟種子分離得到，Luteibacter、Paenibacillus只從“和620S”種子分離得到。

表3 雜交水稻恢復系“16A007”種子內(nèi)生細菌分布

本實驗中的成熟水稻親本種子內(nèi)生優(yōu)勢菌種存在差異?！吧?8S”種子內(nèi)生細菌第一優(yōu)勢菌種是RhizobiumlarrymooreiATCC 51759T(JADW01000071)，第二優(yōu)勢菌種是Sphingomonassanguinis，第三優(yōu)勢菌種是Rothiamarina。“和620S”種子內(nèi)生細菌第一優(yōu)勢種為Curtobacteriumcitreum，第二優(yōu)勢菌種是Microbacteriumhydrothermale，第三優(yōu)勢菌種是Rhizobiumlarrymoorei?！?6A007”種子內(nèi)生細菌第一優(yōu)勢菌種為Flavobacteriumacidificum，第二優(yōu)勢菌種為Micrococcusantarcticus，第三優(yōu)勢菌種為Pseudomonasoryzihabitans。

“深08S”、“和620S”和“16A007”成熟種子存在共同的內(nèi)生菌種。Pseudomonasoryzihabitans是“16A007”的第三優(yōu)勢菌種，是“和620S”和“深08S”的并列第五優(yōu)勢菌種；Rhizobiumlarrymoorei是“16A007”的第四優(yōu)勢菌種，是“和620S”的第三優(yōu)勢菌種，也是“深08S”的第一優(yōu)勢菌種；Rothiamarina是“深08S”的第三優(yōu)勢菌種，也是“16A007”的并列第五優(yōu)勢菌種；Curtobacteriumcitreum是“和620S”的第一優(yōu)勢菌種，也是“深08S”的并列第五優(yōu)勢菌種；Sphingomonassanguinis是“深08S”的第二優(yōu)勢菌種，也是“和620S”并列第五優(yōu)勢菌種。

3 討 論

植物內(nèi)生菌是一類非常重要的資源，現(xiàn)已成為植物學、微生物學、植物保護學及作物育種學等多學科研究的熱點[8]。自然界中存在約100萬種植物內(nèi)生菌[22]，但如此龐大的內(nèi)生菌群至今被發(fā)現(xiàn)的還不到總數(shù)的15%[23]。目前在各種農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)超過54個屬129種以上的內(nèi)生細菌，還有很多潛在的內(nèi)生細菌未被發(fā)現(xiàn)[24-25]。目前，己報道的水稻內(nèi)生細菌種類為33屬64種[26]。水稻種子表面及其內(nèi)部存在豐富的微生物群落資源，是多種有益微生物和病原菌的傳遞載體。本研究以優(yōu)異雜交水稻親本“深08S”、“和620S”及“16A007”種子為研究對象，通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，對其處于成熟期的種子內(nèi)生細菌群落多樣性進行研究，旨在探究種子形成后種子內(nèi)生細菌群落結構的特點及多樣性，擬獲得一批有益的內(nèi)生菌資源，為開發(fā)新的植物益生菌劑奠定資源基礎，同時揭示同一水稻材料種子形成不同時期內(nèi)生細菌群落的相關性。

表4 雜交水稻親本種子內(nèi)生優(yōu)勢菌屬及其豐度分析匯總Tab.4 Comparison of dominant genera from three seed samples of hybrid rice parents %

研究結果發(fā)現(xiàn)，處于成熟期的雜交水稻親本種子內(nèi)生細菌群落結構具有多樣性。成熟種子“深08S”種子內(nèi)生細菌分屬Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes及Bacteroidetes 4個類群，22個菌屬，具有40個OTU，前3個優(yōu)勢菌屬分別為Rhizobium(15.83%)、Bacillus(14.99%)、Sphingomonas(9.17%)及Curtobacterium(9.17%)；“和620S”種子內(nèi)生細菌分屬Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria 3個類群，12個菌屬，具有20個OTU，前3個優(yōu)勢菌屬分別為Curtobacterium(25.33%)、Microbacterium(15.99%)及Pantoea(11.99%)；“16A007”種子內(nèi)生細菌分屬Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria 3個類群，14個菌屬，具有24個OTU，前3個優(yōu)勢菌屬分別為Pantoea(35.00%)、Micrococcus(11.00%)及Pseudomonas(8.00%)。

本課題組曾對處于灌漿期的上述雜交水稻親本種子內(nèi)生細菌群落結構的多樣性研究，發(fā)現(xiàn)灌漿期“深08S”種子內(nèi)生細菌分屬Proteobacteria及Bacteroidetes 2個類群，5個菌屬，具有6個OTU，前3個優(yōu)勢菌屬分別為Pantoea(52.04%)、Pseudomonas(31.63%)及Rhizobium(10.20%)；“和620S”種子內(nèi)生細菌分屬Proteobacteria及Actinobacteria類群，5個菌屬，具有10個OTU，前4個優(yōu)勢菌屬分別為Pantoea(69.02%)、Pseudomonas(18.32%)、Rhizobium(5.64%)及Sphingomonas(5.64%)?！?6A007”種子內(nèi)生細菌分屬Proteobacteria 1個類群，6個菌屬，具有11個OTU，前3個優(yōu)勢菌屬分別為Pseudomonas(45.12%)、Pantoea(41.46%)及Sphingomonas(6.10%)。

從實驗結果可以看出成熟期的雜交水稻親本種子分離獲得的種子內(nèi)生菌群落種類更多，內(nèi)生菌群落更具有多樣性。研究表明同一水稻品種不同時期菌群種類、內(nèi)生優(yōu)勢菌屬及其豐度均存在一定差異，內(nèi)生細菌的種類、優(yōu)勢菌屬及其豐度隨種子成熟度而變化；不同水稻品種同一時期菌群種類、內(nèi)生優(yōu)勢菌屬及其豐度均存在一定差異，種子內(nèi)生菌的組成與品種有一定的關系。同一植物不同生長時期的環(huán)境不同，會影響植物內(nèi)生菌群落結構及其多樣性的變化[27]。種子作為植物個體發(fā)育的一個特定階段，含有淀粉、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，為微生物的生長和繁殖提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，種子內(nèi)部營養(yǎng)成分及其變化對與種子聯(lián)合的細菌群落具有重要的影響，種子的營養(yǎng)成分與其相聯(lián)合的細菌可能存在一定相關性[28]，特別是在種子發(fā)育過程中，淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的積累和水分含量的變化會直接影響與其聯(lián)合的細菌的群落結構組成[7]。不同水稻品種同一時期環(huán)境、氣候條件等相同，內(nèi)生菌種類、內(nèi)生優(yōu)勢菌屬及其豐度的差異，與品種有一定的關系，表明基因型能夠影響內(nèi)生細菌群落結構。本課題組曾開展了雜交稻種子及其親本內(nèi)生細菌群落多樣性研究，發(fā)現(xiàn)不同基因型的雜交稻種子內(nèi)生細菌優(yōu)勢菌群、豐度等均存在一定差異，并且與其親本有一定的相關性[28-30]。

本研究利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法對成熟期的雜交水稻親本“深08S”、“和620S”及“16A007”種子內(nèi)生細菌群落多樣性進行研究，為進一步挖掘植物與內(nèi)共生細菌間的互作關系提供參考依據(jù)；同時，也為進一步挖掘種子形成不同時期內(nèi)生細菌群落的相關性提供了參考依據(jù)。實驗分離獲得豐富的水稻種子內(nèi)生細菌資源，為篩選生防促生作用明顯、拮抗譜較廣且定殖能力良好的植物益微菌劑奠定資源基礎。

致謝：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心程池教授在本研究工作中提供了指導與幫助，在此特表示衷心感謝。

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(責任編輯：李 寧)

DiversityofEndophyticBacterialCommunitiesinThreeParentalSeedsofHybridRice(OryzasativaL.)atMaturityStage

LI Nannan1, 2, 3, LI Ni1, CAO Yanhua2, ZHANG Xin2, XIAO Ming3,*, LIU Yang2,*, WANG Weiping1,4,*

(1.StateKeyLaboratoryofHybridRice,HunanHybridRiceResearchCenter,Changsha410125,China;2.ChinaCenterofIndustrialCultureCollection(CICC),ChinaNationalResearchInstituteofFoodandFermentationIndustries,Beijing100015,China;3.CollegeofLifeSciences,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234,China; 4.SouthernRegionalCollaborativeInnovationCenterforGrainandOilCropsinChina,Changsha410128,China)

The objective of this study was to investigate the endophytic bacterial communities in the seeds of three rice (“Shen 08S”, “He 620S” and “16A007”) in maturity stage. Experimental results showed that the parental seeds of hybrid rice had diversity of the bacterial community structure at maturity stage. The endophytic bacterial communities in “Shen 08S” included 40 OTUs, they were belonged to Firmicutes,Proteobacteria,Actinobacteria and Bacteroidetes, among them, the abundance of the first dominant bacteriumRhizobiumwas 15.83%, the second and third dominant bacterium wasBacillus, the third dominant bacterium wasSphingomonasandCurtobacterium; The endophytic bacterial communities in “He 620S” included 20 OTUs, they were belonged to Firmicutes,Proteobacteria and Actinobacteria, the abundance of the first dominant bacteriumCurtobacteriumwas 25.33%,the second and third dominant bacterium wasMicrobacteriumandPantoea, respectively; the endophytic bacterial communities in “16A007” included 24 OTUs, belong to Firmicutes,Proteobacteria and Actinobacteria, the abudance of the first dominant bacteriumPantoeawas 35.00%, the second and third dominant bacterium wasMicrococcusandPseudomonas, respectively.From this study, we found that the endophytic bacteria species in the seeds changed with seed maturation, and the seeds in maturity stage were richer in endophytes resources, which can lay the foundation for the development of new microbial inoculants, and the endophytic bacterial community structure has certain relevance in the seeds of hybrid rice which are genetically related.

parent of hybrid rice; maturity stage; seed endophytic bacteria; culture-independent method; bacterial diversity

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.04.008

2095-6002(2017)04-0056-09

李南南，黎妮，曹艷花，等. 3個雜交水稻親本成熟期種子內(nèi)生細菌多樣性研究[J]. 食品科學技術學報，2017,35(4):56-64. LI Nannan, LI Ni, CAO Yanhua, et al. Diversity of endophytic bacterial communities in three parental seeds of hybrid rice (OryzasativaL.) at maturity stage[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(4):56-64.

2016-05-25

雜交水稻國家重點實驗室開放課題基金(2014KF06)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項—中國超級稻重點區(qū)域目標產(chǎn)量高效育種技術集成與示范(201403002)；北京市科技新星計劃項目(Z141105001814095)。

李南南，女，碩士研究生，研究方向為微生物區(qū)系分析與分類鑒定；

TS201.3

： A

*肖 明，男，教授，博士，主要從事微生物與植物的相互作用與微生物分子生物學方面的研究，通信作者；

*劉 洋，男，高級工程師，博士，主要從事微生物分類鑒定與植物內(nèi)生菌方面的研究，通信作者；

*王偉平，男，副研究員，博士，主要從事水稻育種與種子學方面的研究，通信作者。