周 立，李紹剛，殷偉杰，徐海苗

細(xì)胞塊在宮頸液基細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用

周 立1，李紹剛1，殷偉杰1，徐海苗2

目的探討細(xì)胞塊(cell block, CB)在宮頸液基細(xì)胞學(xué)(liquid-based preparation, LBP)中的應(yīng)用價(jià)值。方法選擇LBP陽性標(biāo)本285例，其中高危HPV 16型45例、HPV 18型58例，HPV高危其他型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)182例，同時(shí)制作成CB并行陰道鏡活檢247例，最終均以組織學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果對(duì)于非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells, ASC)，應(yīng)用LBP與LBP+CB檢測(cè)同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率差異有顯著性(72.3%±2.3%vs83.2%±1.1%，P<0.01)，其中診斷為非典型鱗狀上皮細(xì)胞-意義不明的(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)標(biāo)本中，LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率分別為66.28%(57/86)、78.85%(41/52)；診斷為非典型鱗狀上皮細(xì)胞-不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(atypical squamous cells,cannot exclude hsil, ASC-H)標(biāo)本中，LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率分別為82.98%(39/47)、89.74%(35/39)。對(duì)于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)，LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率比LBP高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而對(duì)≥高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)和非典型腺細(xì)胞(atypical glandular cells, AGC)，LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率一致；在62例LBP診斷LSIL標(biāo)本中，CB診斷分別為無上皮內(nèi)病變或惡性病變(negative for squamous intraepithelial lesions or malignancy, NILM) 2例、ASC-US 7例、ASC-H 10例、LSIL 33例、HSIL 10例；對(duì)于50例LBP診斷HSIL標(biāo)本中，CB診斷分別為ASC-US 2例、ASC-H 11例、LSIL 5例、HSIL 30例、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)2例。HSIL、NILM、LSIL組中p16表達(dá)差異有顯著性(P<0.05)。另外，p16在HSIL組中的陽性表達(dá)明顯高于LSIL組。結(jié)論CB在LBP中的應(yīng)用，可以提高宮頸癌篩查的組織學(xué)陽性符合率，也可作為臨床高度懷疑有病變或高危HPV而LBP未見陽性的一種補(bǔ)充，值得在臨床細(xì)胞病理學(xué)中推廣。

細(xì)胞塊；宮頸液基細(xì)胞學(xué)；組織學(xué)陽性符合率；p16

子宮頸癌是我國(guó)婦女最常見的惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病率呈上升和年輕化的趨勢(shì)。因此，子宮頸癌的早期診斷十分重要[1]。目前，臨床常用方法為宮頸液基細(xì)胞學(xué)(liquid-based preparation, LBP)檢查，細(xì)胞涂片的診斷中仍然存在相當(dāng)數(shù)量的假陽性和假陰性[2]。細(xì)胞塊(cell block, CB)是重要的細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)，其不僅有助于觀察細(xì)胞團(tuán)的結(jié)構(gòu)，而且還可以做免疫組化和分子病理檢查，已被越來越多地應(yīng)用于各種細(xì)胞學(xué)檢查中[3]。本文著重探討CB在LBP中的應(yīng)用價(jià)值，旨在提高LBP的陽性符合率。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集寧波市奉化區(qū)人民醫(yī)院2013年9月～2014年6月選擇LBP與高危HPV型雙陽性標(biāo)本285例，高危HPV 16型45例、HPV 18型58例，HPV高危其他型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)182例；制作成CB并行陰道鏡活檢247例，其中非典型鱗狀上皮細(xì)胞-意義不明的(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)86例、非典型鱗狀上皮細(xì)胞-不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的(atypical squamous cells, cannot exclude hsil, ASC-H)47例、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)62例、≥高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)50例、非典型腺細(xì)胞(atypical glandular cells, AGC)2例；輕度糜爛64例，中度糜爛80例，重度糜爛103例；患者年齡19～70歲，平均43.2歲，30～49歲為高發(fā)年齡。

1.2方法

1.2.1LBP制作 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本采用美生液基細(xì)胞學(xué)制片機(jī)制片，95%乙醇固定，巴氏染色，根據(jù)TBS診斷標(biāo)準(zhǔn)簽發(fā)病理學(xué)報(bào)告，并將剩余標(biāo)本制成CB。

1.2.2HPV檢測(cè) 采用羅氏(Roche)Cobas 4800 HPV檢測(cè)技術(shù)。

1.2.3CB制作 將滿足LBP制片后剩余的標(biāo)本倒入10 mL試管，離心沉淀(2 500～3 000 r/min，5 min)；若標(biāo)本為血性，應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，沉淀物用冰醋酸乙醇液(5 mL冰醋酸、95 mL 25%乙醇)清洗振蕩(1 000 r/min，5～10 min)，離心沉淀(1 000～1 500 r/min，10 min)；加入10%中性福爾馬林10 mL，細(xì)胞懸浮固定1 h，離心沉淀(2 500～3 000 r/min)，5 min；吸干上清液，加入95%乙醇，離心沉淀(3 000 r/min，靜止30 min使細(xì)胞凝成團(tuán)塊，棄上清液，用棉簽輕輕將CB取出；用包埋紙將CB包埋，放入100%乙醇中脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋成塊切片。

1.2.4免疫組化法 即用型p16鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自福州邁新公司。所有CB連續(xù)3 μm厚切片，于60 ℃烘干1 h，免疫組化采用SP法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固，置顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷

1.3.1細(xì)胞學(xué)診斷 采用TBS分級(jí)系統(tǒng)[4]，即：無上皮內(nèi)病變或惡性病變(negative for squamous intraepithelial lesions or malignancy, NILM)、ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)、 AGC、腺癌。

1.3.2陰道鏡檢查并取活檢組織學(xué)診斷 采用美國(guó)WAFCACH雙目陰道鏡，專人檢查，分別將醋酸白試驗(yàn)及碘試驗(yàn)圖像存入電腦或打印存檔，同時(shí)在其監(jiān)視下對(duì)異常圖像處進(jìn)行多點(diǎn)活檢，如無異常圖像者進(jìn)行子宮頸3、6、9、12點(diǎn)處活檢送病理檢查。組織學(xué)診斷：(1)正常或炎癥；(2)子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)，按輕、中、重分為CIN 1、CIN 2、CIN 3或原位癌(carcinoma in situ, CIS)；(3)浸潤(rùn)癌，組織病理陽性診斷是CIN 1及以上病變。

1.3.3HPV檢測(cè)診斷 診斷標(biāo)準(zhǔn)：140為陰性。

1.3.4免疫組化判斷 p16陽性細(xì)胞定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，由兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分比分別進(jìn)行評(píng)定和分析，結(jié)果判斷均采用統(tǒng)一評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和雙盲法。 按照陽性細(xì)胞數(shù)比例分：<1%為0分；1%～9%為1分；10%～33%為2分；34%～66%為3分；>66%為4分。依據(jù)染色強(qiáng)度分：無著色為0分；弱著色為1分；中等強(qiáng)度著色為2分；強(qiáng)著色為3分。將兩項(xiàng)得分相乘：0分為(- )，1～4分(+)，5～8分為()，9～12分為()。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法診斷以病理活檢為標(biāo)準(zhǔn)，各組資料以mean±S.E.M表示，采用SPSS 11.5軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行two-way ANOVE方差分析，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異極其顯著。

2 結(jié)果

2.1LBP陽性標(biāo)本中LBP與LBP+CB的組織學(xué)分析在ASC中，LBP與LBP+CB的檢測(cè)陽性率差異有顯著性(72.3%±2.3%vs83.2%±1.1%，P<0.01)；在LSIL中，LBP+CB的組織學(xué)陽性率比LBP稍高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而對(duì)≥HSIL和AGC，LBP與LBP+CB的檢測(cè)陽性率基本相當(dāng)(圖1)。

圖1 LBP陽性標(biāo)本中兩組組織學(xué)診斷比較(n=247)

2.2ASC標(biāo)本中LBP與LBP+CB的組織學(xué)診斷比較133例ASC標(biāo)本中ASC-US 86例、ASC-H 47例。ASC-US中LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率分別為66.28%(57/86)、78.85%(41/52)；ASC-H中LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率分別為82.98%(39/47)、89.74%(35/39)，兩組比較差異有顯著性(P<0.05，表1)。

表1 ASC標(biāo)本中兩組組織學(xué)診斷比較(n=133)

2.3LBP診斷為鱗狀上皮內(nèi)病變中對(duì)應(yīng)CB的結(jié)果在62例LBP診斷LSIL標(biāo)本中，CB診斷分別為NILM 2例、ASC-US 7例、ASC-H 10例、LSIL 33例、HSIL 10例；在50例LBP診斷HSIL標(biāo)本中，CB診斷分別為ASC-US 2例、ASC-H 11例、LSIL 5例、HSIL 30例、SCC 2例(表2)。

表2 LBP診斷為鱗狀上皮內(nèi)病變標(biāo)本中對(duì)應(yīng)CB的結(jié)果(n=112)

2.4p16的表達(dá)p16在對(duì)照組中黏液柱狀上皮和鱗狀上皮細(xì)胞均呈陰性。在15例CB陰性標(biāo)本中，6例標(biāo)本呈弱陽性，占40.00%；在10例LSIL標(biāo)本中，7例標(biāo)本呈陽性，占70.00%；在20例HSIL標(biāo)本中，19例標(biāo)本呈陽性，占95.00%。HSIL、NILM、LSIL組中p16表達(dá)差異有顯著性(P<0.05，圖2)。另外，p16在HSIL組中的陽性表達(dá)明顯高于LSIL組(圖3)。

3 討論

LBP是子宮頸癌及癌前病變的初篩法，但其在一些因素的影響下，仍存在一定的假陰性和假陽性。在假陰性病例中，主要是由于血性/炎性的背景造成的[5]；假陽性的主要因素包括以下方面[6]：(1)由于炎癥、感染，出現(xiàn)化生、修復(fù)、萎縮細(xì)胞、細(xì)胞核較大或細(xì)胞質(zhì)減少的細(xì)胞，可能誤診為病變細(xì)胞。(2)細(xì)胞學(xué)查見陽性細(xì)胞但陰道鏡活檢未取到病變部位。

圖2 CB中p16的表達(dá)

ABCD

圖3p16的表達(dá)，SP法：A.LSIL；B.HSIL；C.SCC；D.原位腺癌

CB在HE染色形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道相似[7]：細(xì)胞境界、核膜、核染色質(zhì)、核仁清楚；也有一定的巢狀、片狀、管狀結(jié)構(gòu)和排列方式，減少標(biāo)本中的血液、黏液、炎癥細(xì)胞等干擾因素；CB也為免疫組化和分子病理學(xué)創(chuàng)造條件。本組發(fā)現(xiàn)HSIL、NILM、LSIL組中p16表達(dá)，差異有顯著性(P<0.05)。另外，p16在HSIL組中的陽性表達(dá)明顯高于LSIL組，且陽性定位準(zhǔn)確，著色優(yōu)良，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，但針對(duì)15例CB陰性標(biāo)本中，6例標(biāo)本呈弱陽性，可能是由于病毒感染初期，細(xì)胞形態(tài)改變不明顯或子宮頸取材未取到典型病灶有關(guān)[9]。對(duì)于病變細(xì)胞量較少的標(biāo)本，較難制成CB或者CB陽性率下降。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LBP與LBP+CB的組織學(xué)陽性符合率分別為82.99%(205/247)、90.73%(186/205)，兩者相比差異有顯著性(χ2=5.74，P<0.05)。在ASC中，LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率差異有顯著性，其中診斷為ASC-US標(biāo)本中，LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率分別為66.28%(57/86)、78.85%(41/52)；診斷為ASC-H標(biāo)本中，LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率分別為82.98%(39/47)、89.74%(35/39)。LSIL中LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率較LBP稍高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而對(duì)于≥HSIL和AGC，LBP與LBP+CB同時(shí)陽性的組織學(xué)陽性符合率基本相當(dāng)；在62例LBP診斷LSIL標(biāo)本中，CB分別診斷NILM 2例、ASC-US 7例、ASC-H 10例、LSIL 33例、HSIL 10例；對(duì)于50例LBP診斷HSIL標(biāo)本中，CB分別診斷為ASC-US 2例、ASC-H 11例、LSIL 5例、HSIL 30例、SCC 2例。

綜上所述，應(yīng)用CB制作提高了子宮頸癌篩查的組織學(xué)陽性符合率，可作為臨床高度懷疑有病變或是高危HPV型而LBP未發(fā)現(xiàn)陽性的補(bǔ)充檢測(cè)技術(shù)，值得在臨床細(xì)胞病理學(xué)中推廣。

[1] Koss L G, Lin E, Schreiber K,etal. Evaluation of the PATNET cytologic screening systemfor quality control of cervical smears[J]. Am J Clin Path, 1994,101:220-229.

[2] 李 旻，楊 平，羅東蘭，等. 影響宮頸液基細(xì)胞學(xué)高度鱗狀上皮內(nèi)病變?cè)\斷的因素分析[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2012,41(4):265-268.

[3] 何洪敏，張 麗，張 亞，任玉波. 介紹一種制作細(xì)胞塊的專用離心管[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2013,42(12):833-834.

[4] Solomon D, Davey D, Kurman R,etal. The 2001 bethesda system:terminology for reporting results of cervical cytology[J]. JAMA, 2002,287(16):2114-2119.

[5] 石新蘭，張 寧，崔鐵莉，等. 血性/炎性涂片背景對(duì)宮頸液基細(xì)胞學(xué)診斷的影響[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2012,28(7):810-812.

[6] 王智園，張維彬，石靈春. 宮頸液基細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)診斷結(jié)果對(duì)照及誤差分析[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,25(5):465-467.

[7] 張桂珍，朱甄達(dá)，陳 程. 纖支鏡毛刷細(xì)胞塊技術(shù)的應(yīng)用方法和價(jià)值[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生, 2013,51(36):75-77.

[8] Yu L, Wang L, Zhong J, Chen S. Diagnostic value of p16INK4A, Ki-67, and human papillomavirus L1 capsid protein immunochemical staining on cell blocks from residual liquid-based gynecologic cytology specimens[J]. Cancer Cytopathol, 2010,118(1):47-55.

[9] 李紹剛，殷偉杰，李賽飛. 238例宮頸細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)對(duì)照分析及p16在組織學(xué)診斷中的應(yīng)用[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2015,31(3):330-332.

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周 立，男，技師。E-mail: 826346947@qq.com 徐海苗，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: xuhaimiao@126.com

R 737.3

:B

1001-7399(2017)07-0790-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.020

接受日期：2017-05-09