王 銘，張麗華

等位基因特異性PCR法對血液和腫瘤組織EGFR基因突變的比較

王 銘，張麗華

目的采用等位基因特異性PCR法檢測肺癌患者循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)和腫瘤組織樣本中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變，分析兩者關(guān)系及檢測ctDNA EGFR突變的臨床應用價值。方法收集22例非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的血液樣本和腫瘤組織樣本，提取相應血漿游離DNA(cfDNA)和腫瘤組織DNA(tDNA)，通過等位基因特異性PCR法分別檢測EGFR第18～21號外顯子突變，并將兩種樣本結(jié)果進行比較分析。結(jié)果22例NSCLC中，8例血液樣本存在EGFR突變，突變率36.4%(8/22)；13例腫瘤組織樣本有EGFR突變，突變率59.1%(13/22)；16例血液樣本和腫瘤組織樣本EGFR檢測結(jié)果完全一致。以tDNA檢出結(jié)果為標準，ctDNA診斷EGFR基因突變敏感度為61.5%，特異度為100%；與tDNA結(jié)果的一致率為72.7%。結(jié)論等位基因特異性PCR法檢測ctDNA的EGFR基因突變，為無法獲取腫瘤組織標本患者提供新的檢測機會。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；血漿；表皮生長因子受體；突變

近年表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)的應用，有效提高肺癌患者的生存率[1-2]，國內(nèi)外臨床指南均推薦在EGFR-TKIs治療前行EGFR基因突變檢測。由于活檢侵入性的檢查未能反映治療過程中腫瘤基因狀態(tài)和對藥物敏感性的動態(tài)變化，而血液樣本因其非侵入性、可實時監(jiān)測的特點成為目前分析熱點[3-5]。由于外周血中循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)含量低，對檢測血液樣本基因突變的手段提出了挑戰(zhàn)[6-7]。本實驗采用等位基因特異性PCR法分別對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者石蠟包埋腫瘤組織和血液樣本進行EGFR突變檢測，以腫瘤組織檢測結(jié)果為標準，評價等位基因特異性PCR法檢測ctDNA EGFR突變的效能，并探討ctDNA EGFR檢測的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2016年4月～2016年7月東南大學附屬中大醫(yī)院心胸外科手術(shù)切除標本7例，呼吸科支氣管鏡活檢、經(jīng)皮肺穿刺活檢及支氣管刷片標本11例，胸水離心后細胞塊標本4例。所有標本均經(jīng)病理科醫(yī)師確診為NSCLC，其中肺腺癌患者21例，肺鱗癌患者1例?；颊呔押炇鹬橥鈺?。

1.2血漿標本22例NSCLC患者于取組織前72 h抽取全血7 mL，置于EDTA抗凝管，并在抽取后2 h內(nèi)于3 000 r/min離心10 min，2 mL血漿移到無菌離心管，檢測前凍存于-80 ℃。

1.3儀器與試劑實驗儀器采用羅氏公司Light Cycler 4800 v2.0熒光定量PCR儀；10%中性福爾馬林固定腫瘤組織樣本、血液樣本分別采用羅氏公司核酸提取試劑盒和血漿游離DNA(cfDNA)樣本制備試劑盒提取相應DNA；腫瘤組織樣本、血液樣本分別采用羅氏Cobas EGFR突變檢測試劑盒v1.0和v2.0檢測EGFR突變。

1.4腫瘤組織DNA(tDNA)的提取按照羅氏公司核酸提取試劑盒說明書提取tDNA，紫外分光光度計測定所提DNA濃度及純度，檢測時將DNA稀釋到2 ng/μL。

1.5cfDNA的提取采用羅氏公司cfDNA樣本制備試劑盒，具體操作參考試劑盒說明書進行，提取后隨即進行檢測。

1.6EGFR突變檢測采用羅氏公司Light Cycler 4800 v2.0熒光定量PCR儀，按照羅氏Cobas EGFR突變檢測試劑盒v1.0和v2.0說明書進行操作，對提取的tDNA和cfDNA分別進行EGFR突變檢測。

1.7統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，通過Fisher確切概率法計算不同性別、年齡、吸煙史、病理分期、組織類型的腫瘤組織標本和血漿標本EGFR 突變是否存在差異；應用Kappa一致性檢驗比較血漿樣本和腫瘤組織樣本EGFR檢測結(jié)果的一致性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1臨床特點本組22例患者中，女性12例(54.5%)，男性10例(45.5%)；年齡46～83歲，平均66.3歲；吸煙患者3例(13.6%)，不吸煙患者19例(86.4%)；Ⅰ期患者2例(9.1 %)，Ⅱ期患者2例(9.1 %)，Ⅲ期患者4例(18.2 %)，Ⅳ期患者14例(63.6%)；肺腺癌患者21例(95.5 %)，肺鱗癌患者1例(4.5%)(表1)。

表1 肺癌患者臨床資料及EGFR檢測

2.2腫瘤組織樣本與血漿樣本分析在22例患者中，血漿樣本EGFR突變陽性率為36.4%(8/22)，組織樣本EGFR突變陽性率為59.1%(13/22)(表2)。16例血漿標本和組織標本EGFR檢測結(jié)果完全一致，一致率為72.7%(Kappa=0.567)；14例血漿檢測陰性的結(jié)果中，9例與腫瘤組織檢測結(jié)果一致，陰性一致率為64.3%(9/14)(Kappa=0.314)；8例血漿檢測陽性的結(jié)果，7例與腫瘤組織檢測結(jié)果完全一致，陽性一致率為87.5%(7/8)(Kappa=0.750)，另外1例結(jié)果不一致的患者，血漿樣本檢測結(jié)果為21外顯子L858R和19del突變，而腫瘤組織樣本僅檢測到21外顯子L858R突變。以tDNA檢出的結(jié)果為標準，ctDNA診斷NSCLC EGFR基因突變的敏感度為61.5%，特異度達100%(表3)。

表2 肺癌患者臨床病理特征及EGFR突變情況

表3 腫瘤組織樣本和血液樣本EGFR突變的關(guān)系

3 討論

有研究顯示，EGFR突變狀態(tài)也可作為患者的預后標志物[8]。因此，明確患者EGFR突變狀態(tài)對于預測患者預后、指導其臨床用藥、判斷EGFR-TKIs療效至關(guān)重要。目前，腫瘤組織學標本進行EGFR基因突變檢測用于指導NSCLC患者EGFR-TKIs治療已在全球形成共識，成為檢驗的金標準[9]，但是許多進展期的患者喪失手術(shù)機會，無法獲得組織標本用于EGFR基因檢測；穿刺活檢除對患者存在創(chuàng)傷，也會增加腫瘤種植轉(zhuǎn)移的風險。因此，獲得腫瘤組織標本進行基因突變檢測存在諸多困難，探討組織標本替代品勢在必行。與傳統(tǒng)手術(shù)和活檢標本相比，血液樣本可通過微創(chuàng)手段獲得，具有取材方便、無創(chuàng)傷、患者依從性好等優(yōu)點[1,10]。另外，外周血標本中ctDNA是特征性的腫瘤生物學標志物之一，可實時反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展或治療過程中的信息，便于指導臨床及時調(diào)整治療策略[1]。因此，通過血液標本檢測ctDNA基因突變成為近年來國內(nèi)外分析的熱點。

cfDNA EGFR基因突變檢測的關(guān)鍵問題是cfDNA的富集提取法以及高靈敏度的檢測法。目前，臨床cfDNA EGFR基因突變的檢測多采用二代測序法，其費用昂貴、過程繁瑣復雜、耗時長，并且對取材和操作技術(shù)要求較高[11-12]。本實驗采用操作簡單、均一性和重復性較好、靈敏度相對較高的等位基因特異性PCR法。

一項大型針對1 591例肺癌患者(大部分為中國人)、用不同方法檢測血漿EGFR突變的Meta分析結(jié)果顯示，以腫瘤組織EGFR突變結(jié)果為標準，血漿EGFR檢測敏感性為64.5%，特異性為88.5%[13]，ctDNA檢測EGFR突變的特異性較高，而敏感性較低，因此對于血漿EGFR突變陰性結(jié)果的解讀必需慎重，避免假陰性結(jié)果。2015年一份包含27項研究、3 110個肺癌患者(大部分為亞洲人)的Meta分析結(jié)果顯示，血液標本與腫瘤組織相比，血液ctDNA檢測EGFR突變有更高的準確度和特異性，是檢測EGFR突變狀態(tài)的有效生物學標志物[10]。

本組采用羅氏等位基因特異性PCR法檢測22例NSCLC患者，8例血漿樣本中檢測到EGFR突變，13例組織樣本中檢測到EGFR突變；突變均為外顯子19缺失或21外顯子L858R突變。其中，10例男性患者中3例突變陽性，突變率為30%，12例女性患者中10例突變陽性，突變率為83.3%，女性的突變率顯著高于男性，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)，男女性患者血漿與組織樣本EGFR結(jié)果的一致率分別為80%(Kappa=0.412)、66.7%(Kappa=0.333)；非吸煙患者EGFR突變陽性率差異無統(tǒng)計學意義，血漿與組織樣本EGFR結(jié)果的一致率為68.4%(Kappa=0.424)。另外，不同病理分期的患者組織樣本EGFR突變差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)；血漿樣本差異均無統(tǒng)計學意義，Ⅳ期患者血漿與組織樣本EGFR結(jié)果的一致率為78.6%(Kappa=0.571)；腺癌與鱗癌患者EGFR突變陽性率差異無統(tǒng)計學意義，腺癌患者血漿與組織樣本EGFR結(jié)果的一致率為71.4%(Kappa=0.471)。本實驗以tDNA為標準，ctDNA診斷EGFR基因突變的敏感度為61.5%、特異度為100%，與tDNA結(jié)果的總體符合率為72.7%(Kappa=0.567)。本組1例患者腫瘤組織樣本檢測結(jié)果為21外顯子L858R突變，血漿樣本結(jié)果為21外顯子L858R和19del突變，兩種結(jié)果的不一致性可能由腫瘤組織或者轉(zhuǎn)移灶的異質(zhì)性引起，血液標本則克服了這種不一致性。

目前，液體活檢還不能取代組織活檢的金標準地位，但在難以獲取腫瘤組織時，血漿可以作為替代選擇方案用于檢測EGFR[14]。由于本實驗患者數(shù)量較少，對于血漿與組織樣本EGFR結(jié)果的一致性以及患者性別、吸煙史、病理分期、組織學類型EGFR突變差異需擴大樣本量進一步分析，以提供更有力的依據(jù)。

[1] 李 昊, 鐘 理, 丁 浩, 沈志高. 肺癌個體化治療的現(xiàn)狀及展望[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2014,30(2):196-199.

[2] Zhou C, Wu Y L, Chen G,etal. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study[J]. Lancet Oncol, 2011,12(8):735-742.

[3] 高勝男，張嘉玲，呼 群. 非小細胞肺癌患者循環(huán)腫瘤DNA的研究進展[J]. 腫瘤學雜志, 2016,22(3):172-175.

[4] 王曉玫. 影響肺活檢小標本組織病理學診斷準確性因素分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2008,24(3):262-265.

[5] Remon J, Moran T, Majem M,etal. Acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in EGFR-mutant non-small cell lung cancer: a new era begins[J]. Cancer Treat Rev, 2014,40(1):93-101.

[6] Misale S, Yaeger R, Hobor S,etal. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer[J]. Nature, 2012,486(7404):532-536.

[7] Chan K C, Jiang P, Zheng Y W,etal. Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing[J]. Clin Chem, 2013,59(1):211-224.

[8] Wojas-Krawczyk K, Krawczyk P, Mlak R,etal. The applicability of a predictive index for second and third-line treatment of unselected non-small-cell lung cancer patients[J]. Respiration, 2011,82(4):341-350.

[9] Zhao X, Han R B, Zhao J,etal. Comparison of epidermal growth factor receptor mutation statuses in tissue and plasma in stage I-IV non-small cell lung cancer patients[J]. Respiration, 2013,85(2):119-125.

[10] Qiu M, Wang J, Xu Y,etal. Circulating tumor DNA is effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung cancer: a meta-analysis[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2015,24(1):206-212.

[11] Sundaresan T K, Sequist L V, Heymach J V,etal. Detection of T790M, the acquired resistance EGFR mutation, by tumor biopsy versus noninvasive blood-based analyses[J]. Clin Cancer Res, 2016,22(5):1103-1110.

[12] Xu S, Lou F, Wu Y,etal. Circulating tumor DNA identified by targeted sequencing in advanced-stage non-small cell lung cancer patients[J]. Cancer Lett, 2016,370(2):324-331.

[13] Li Z, Zhang Y, Bao W,etal. Insufficiency of peripheral blood as a substitute tissue for detecting EGFR mutations in lung cancer: a meta-analysis[J]. Target Oncol, 2014,9(4):381-388.

[14] Zhang Y, Bao W, Li Z. Limitations in the use of serum epidermal growth factor receptor mutations as prognostic markers for non-small-cell lung cancer[J]. Med Princ Pract, 2015,24(5):486-490.

ComparisonofEGFRmutationsinbloodandtumortissuesamplesbyallele-specificPCR

WANG Ming, ZHANG Li-hua

(DepartmentofPathology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210000,China)

PurposeTo explore the clinical application value of allele specific PCR in detection of ctDNA EGFR mutations by comparing the epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation in tumor tissue specimens and circulating tumor DNA (ctDNA) of lung cancer patients by allele-specific PCR.Methods22 pairs of plasma samples and tumor tissue samples of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients were collected and the corresponding cfDNA and tDNA were extracted. The cobas EGFR mutation test v2.0 and cobas EGFR mutation test were used to detected EGFR 18-21 exon mutation, respectively.ResultsAmong 22 patients with NSCLC, there were 8 cases of EGFR mutations in plasma samples, so the mutation rate was 36.4% (8/22). The presence of EGFR mutations in tumor samples was 13 cases, and the mutation rate was 59.1% (13/22). EGFR mutation status of 16 patients in plasma samples was consistent with tumor tissues. The result of tDNA gene mutations was regarded as the standard. Sensitivity of gene mutations in ctDNA was 61.5%, and specificity was 100%. The concordance rate between result of tDNA and ctDNA was 72.7%.ConclusionDetection of ctDNA EGFR gene mutations by allele-specific PCR provides a new detection opportunity for patients unable to obtain tumor tissue specimens.

lung neoplasm； non-small cell lung cancer； plasma； epidermal growth factor receptor； mutation

時間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.014.html

東南大學附屬中大醫(yī)院病理科，南京 210000

王 銘，女，博士，技師。E-mail: wangyoucao198710@126.com 張麗華，女，博士，副教授，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: 15905179393@126.com

R-331

:A

:1001-7399(2017)07-0769-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.014

接受日期：2017-05-24