潘丹玲，陳小巖，陳靈鋒，林 瀛

非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增檢測及臨床意義

潘丹玲，陳小巖，陳靈鋒，林 瀛

目的探討非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma, ALT/WDL)中MDM2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增，分析MDM2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增在ALT/WDL中的意義。方法采用免疫組化EliVision兩步法及熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測58例ALT/WDL中MDM2蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增狀態(tài)。結(jié)果免疫組化檢測顯示58例ALT/WDL中MDM2蛋白陽性率為79.3%；FISH法檢測MDM2基因擴(kuò)增率為96.5%。免疫組化和FISH檢測結(jié)果陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論MDM2蛋白表達(dá)和MDM2基因擴(kuò)增為ALT/WDL的診斷提供依據(jù)；由于免疫組化檢測陽性率接近80%，故在多數(shù)沒有FISH條件的單位予以開展免疫組化MDM2蛋白檢測，可以幫助診斷大多數(shù)ALT/WDL病例。

非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤；MDM2；免疫組織化學(xué)；熒光原位雜交

非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma, ALT/WDL)是脂肪肉瘤中最常見類型，占脂肪肉瘤的40%～45%，好發(fā)于中老年人，發(fā)病年齡高峰為50～70歲，以男性多見，發(fā)生于腹膜后者以女性略多見[1]。ALT/WDL可發(fā)生于四肢皮下或深部軟組織，臨床上無特殊的癥狀和體征，起病多隱匿，緩慢性生長。ALT/WDL最重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)脂肪母細(xì)胞診斷，但有時(shí)也難以查見典型的脂肪母細(xì)胞，因?yàn)橹灸讣?xì)胞也可出現(xiàn)在某些良性脂肪源性腫瘤內(nèi)，因此ALT/WDL較難診斷。隨著影像學(xué)(如B超檢查)的發(fā)展，在B超引導(dǎo)下穿刺活檢的組織量少也極大地增加ALT/WDL診斷難度。本文現(xiàn)采用免疫組化EliVision兩步法檢測MDM2蛋白表達(dá)，應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)檢測MDM2基因擴(kuò)增狀態(tài)，探討兩者在ALT/WDL病理診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集福建省立醫(yī)院2010年1月～2015年12月手術(shù)或穿刺活檢的ALT/WDL組織標(biāo)本58例，均經(jīng)病理學(xué)明確診斷為ALT/WDL。其中脂肪瘤樣脂肪肉瘤35例，硬化性脂肪肉瘤18例，炎癥性脂肪肉瘤3例，梭形細(xì)胞性脂肪肉瘤2例；年齡39～82歲，平均(50±10)歲；腫物直徑4.2～20 cm；女性26例，男性32例。

1.2方法

1.2.1免疫組化 腫瘤標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片脫蠟，HE染色，免疫組化采用EliVision兩步法染色。MDM2抗體克隆號為SPM14，購自福州邁新公司。

1.2.2FISH法 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，脫蠟，切片預(yù)處理，蛋白酶消化，固定，DNA變性，雜交，DAPI復(fù)染，信號計(jì)數(shù)。ZytoLight SPEC MDM2/CEN 12雙色探針試劑盒，購自德國ZytoVision GmbH公司。

1.3結(jié)果判斷

1.3.1免疫組化判斷 MDM2表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，陽性腫瘤細(xì)胞核呈粗細(xì)不等、深淺不一的棕黃色顆粒即判為陽性。

1.3.2FISH判斷 隨機(jī)計(jì)數(shù)至少20個(gè)腫瘤細(xì)胞核中的雙色信號，根據(jù)MDM2試劑盒說明書判讀結(jié)果。細(xì)胞核內(nèi)存在多個(gè)綠色信號或簇狀綠色信號提示MDM2基因擴(kuò)增，本組56例MDM2高度擴(kuò)增；正常細(xì)胞的間期細(xì)胞核為2個(gè)綠色和2個(gè)紅色信號，提示MDM2基因無擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1組織學(xué)特征ALT/WDL從組織形態(tài)學(xué)可分為4種主要亞型：脂肪細(xì)胞性(脂肪瘤樣)、硬化性、炎癥性、梭形細(xì)胞性，且可以多種亞型并存。鏡下主要由相對成熟的增生脂肪組織構(gòu)成，與良性脂肪源性腫瘤相比，細(xì)胞大小差異有顯著性(核局灶異型性、核深染)，可見數(shù)量不等的單泡或多泡脂肪母細(xì)胞。

2.2MDM2蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增58例ALT/WDL中，MDM2蛋白陽性者46例，陽性率為79.3%(圖1)；56例MDM2基因擴(kuò)增，擴(kuò)增率為96.5%(圖2)。FISH檢測：46例MDM2蛋白陽性者M(jìn)DM2基因均擴(kuò)增；12例MDM2蛋白陰性者10例MDM2基因擴(kuò)增，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.940，P=0.005，表1)。

表1 ALT/WDL中MDM2蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增[n(%)]

①②A②B圖1 MDM2的表達(dá),EliVi-sion兩步法圖2 A.MDM2基因擴(kuò)增;B.MDM2基因無擴(kuò)增

3 討論

WHO(2013)軟組織腫瘤分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)系列將ALT/WDL確定為中間性腫瘤，ALT ICD-O編碼為8850/1，高分化脂肪肉瘤ICD-O編碼為8850/3。ALT/WDL定義為具有局部侵襲性的中間惡性間葉性腫瘤，腫瘤全部或部分由成熟脂肪組織構(gòu)成，細(xì)胞大小差異有顯著性，且脂肪細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核至少有局灶異型性。其中散在的深染核常為多核的間質(zhì)細(xì)胞以及數(shù)量不等的單泡或多泡脂肪母細(xì)胞(存在單個(gè)或多個(gè)界限清楚的胞質(zhì)內(nèi)空泡，扇貝形分布于增大的深染核周圍)有助于診斷。病理學(xué)診斷主要依賴常規(guī)染色切片技術(shù)，經(jīng)光鏡觀察細(xì)胞異型性和結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)對ALT/WDL進(jìn)行診斷。普遍認(rèn)為脂肪母細(xì)胞是所有類型脂肪肉瘤的特征，但是應(yīng)注意僅有脂肪母細(xì)胞不能診斷ALT/WDL，并非所有的ALT/WDL均有脂肪母細(xì)胞。ALT/WDL發(fā)生于深部者具有多次復(fù)發(fā)的可能，并可發(fā)生去分化和轉(zhuǎn)移。

ALT/WDL易與一些良性脂肪源性腫瘤混淆，尤其在穿刺活檢標(biāo)本中，ALT/WDL的診斷難度增大。根據(jù)顯微鏡下腫瘤組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞組成不同，ALT/WDL分為脂肪瘤樣脂肪肉瘤、硬化性脂肪肉瘤、炎癥性脂肪肉瘤、梭形細(xì)胞脂肪肉瘤4種亞型。在日常工作中，ALT/WDL需與以下疾病鑒別。(1)梭形細(xì)胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤：其是同一組腫瘤的兩極表現(xiàn)，屬于少見特殊類型的良性脂肪性腫瘤，部分病例可單純?yōu)樗笮渭?xì)胞或多形細(xì)胞組成，大多數(shù)病例同時(shí)存在兩種形態(tài)學(xué)特征，有時(shí)與梭形細(xì)胞脂肪肉瘤較難鑒別。梭形細(xì)胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤常位于頸、背部皮下組織，為無痛性結(jié)節(jié)，由不同數(shù)量的梭形細(xì)胞、核深染圓形細(xì)胞和多核巨細(xì)胞組成，梭形瘤細(xì)胞無明顯異型性，與脂肪細(xì)胞相互穿插，間質(zhì)可見較粗膠原纖維束。ALT/WDL常位于肢體或腹膜后深部軟組織，鏡下可見核深染的異型間質(zhì)細(xì)胞，腫瘤組織內(nèi)缺乏粗大膠原纖維結(jié)構(gòu)。梭形細(xì)胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤免疫組化標(biāo)記CD34呈陽性，MDM2呈陰性，MDM2基因無擴(kuò)增，與ALT/WDL可資鑒別。(2)脂肪壞死及脂肪肉芽腫：有時(shí)與ALT/WDL難以鑒別，但脂肪壞死及脂肪肉芽腫鏡下見吞噬脂質(zhì)的泡沫組織細(xì)胞，常伴多核巨細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，無異型的脂肪母細(xì)胞，且MDM2蛋白不表達(dá)，MDM2基因無擴(kuò)增，均可與ALT/WDL鑒別。(3)脂肪瘤病需與脂肪瘤樣脂肪肉瘤：脂肪瘤病可累及身體的不同部位，鏡下見脂肪組織彌漫性過度增生，主要是由成熟的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，脂肪細(xì)胞大小形態(tài)一致，無明顯異型細(xì)胞；脂肪瘤樣脂肪肉瘤常見于中老年人，腫瘤內(nèi)可見核深染的異型脂肪母細(xì)胞，且MDM2蛋白表達(dá)、MDM2基因擴(kuò)增，兩者可資鑒別。(4)其他腫瘤：硬化性脂肪肉瘤間質(zhì)大量膠原性纖維，膠原纖維可伴玻璃樣變及鈣化，脂肪母細(xì)胞雖可見，但一般數(shù)量較少，故常與上述梭形細(xì)胞腫瘤難以鑒別，但是硬化性脂肪肉瘤鏡下可見核深染且異型的間質(zhì)細(xì)胞散在分布于膠原纖維及脂肪細(xì)胞中，上述梭形細(xì)胞腫瘤組織均無脂肪細(xì)胞成分，MDM2蛋白一般不表達(dá)，雖偶可表達(dá)，但MDM2基因無擴(kuò)增可資鑒別。

ALT/WDL的診斷與鑒別診斷需依賴于MDM2蛋白與MDM2基因檢測，由此可見免疫組化EliVision兩步法檢測MDM2蛋白表達(dá)與FISH法檢測MDM2基因擴(kuò)增對ALT/WDL病理學(xué)診斷有重要意義。MDM2基因最初發(fā)現(xiàn)于小鼠的第10號染色體C1～C3 區(qū)，是從1個(gè)含有雙微體的自發(fā)轉(zhuǎn)化的BALB/3T3DM細(xì)胞中克隆出來的高度擴(kuò)增基因，在自發(fā)轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。該自發(fā)轉(zhuǎn)化的每個(gè)細(xì)胞含有25～30雙微體，其經(jīng)重組轉(zhuǎn)染后引起基因擴(kuò)增。有文獻(xiàn)報(bào)道人MDM2基因位于染色體12q13-14區(qū)段，MDM2在細(xì)胞由G1期向S期過渡中起調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，其被認(rèn)為能控制正常細(xì)胞的分化和增殖[2-3]，其編碼的蛋白質(zhì)可以與p53蛋白結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)p53蛋白引起腫瘤發(fā)生[4]。ALT/WDL細(xì)胞遺傳學(xué)特征是顯示超額環(huán)狀染色體和巨染色體，其中含有擴(kuò)增的12q13-15序列，這一區(qū)域最恒定的擴(kuò)增是MDM2基因[5-7]。

本組ALT/WDL中MDM2蛋白陽性率為79.3%，MDM2基因擴(kuò)增率為96.5%，與國外文獻(xiàn)[8-12]報(bào)道一致，提示免疫組化檢測MDM2蛋白及FISH技術(shù)檢測MDM2基因是ALT/WDL有效的輔助診斷手段。Binh等[9]也同時(shí)發(fā)現(xiàn)部分惡性間葉性腫瘤，如惡性纖維組織細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、黏液性脂肪肉瘤等，MDM2蛋白也可表達(dá)，但這些惡性間葉源性腫瘤并不存在MDM2基因擴(kuò)增。提示作為ALT/WDL診斷的輔助手段，MDM2蛋白敏感性好但特異性差，對于某些難以診斷的ALT/WDL，如果MDM2的免疫組化不足以支持診斷，或者免疫組化結(jié)果與其他臨床病理特征不符時(shí)，可使用FISH技術(shù)檢測進(jìn)一步確診。值得注意的是，待檢組織中腫瘤成分的多少及標(biāo)本處理等均會影響檢測結(jié)果；同時(shí)石蠟組織保存時(shí)間越久，提取DNA的效果越不理想。本組有2例MDM2基因無擴(kuò)增均為穿刺活檢小標(biāo)本，分析原因可能是真陰性，也可能是技術(shù)或標(biāo)本質(zhì)量原因造成的假陰性，或者是穿刺活檢小標(biāo)本鏡下腫瘤組織極少，因腫瘤的異質(zhì)性造成的假陰性。

本實(shí)驗(yàn)ALT/WDL中MDM2蛋白陽性率為79.3%，MDM2基因擴(kuò)增率為96.5%；MDM2基因陽性組明顯高于MDM2陰性組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MDM2蛋白的表達(dá)和基因擴(kuò)增為ALT/WDL的診斷提供依據(jù)，MDM2基因擴(kuò)增作為獨(dú)特的分子標(biāo)志物在ALT/WDL的診斷中具有較高的敏感性和特異性。由于本組免疫組化EliVision兩步法檢測MDM2蛋白陽性率高，故在大多數(shù)無FISH條件的醫(yī)院行免疫組化標(biāo)記MDM2蛋白的檢測，可以幫助診斷大多數(shù)ALT/WDL患者。

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ClinicalsignificanceofMDM2proteinexpressionandgeneamplificationinatypicallipomatoustumour/well-differentiatedliposarcoma

PAN Dan-ling, CHEN Xiao-yan, CHEN Ling-feng, LIN Ying

(DepartmentofPathology,FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

PurposeThis study was to investigate the clinical significance of MDM2 protein expression and gene amplification in atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma (ALT/WDL).MethodsMDM2 protein expression and gene amplification were detected by immunohistochemistry of EliVision two-step method and fluorescence in situ hybridization (FISH) in 58 cases of ALT/WDL.ResultsImmunohistochemical staining showed that the positive rate of MDM2 was 79.3%, MDM2 gene amplification rate by FISH assay was 96.5%. There was statistically significant differences between immunohistochemistry and FISH (P<0.05).ConclusionMDM2 protein expression and MDM2 gene amplification provide the basis for diagnosis of ALT/WDL. However, a positive rate of MDM2 by immunohistochemistry is nearly 80%, so we recommand to carry out immunohistochemical MDM2 protein detection in most conditions without FISH which can help in the diagnosis of most cases of ALT/WDL.

atypical lipomatous tumour/well-differentiated liposarcoma； MDM2； immunohistochemistry； fluorescence in situ hybridization

時(shí)間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.012.html

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院福建省立醫(yī)院病理科，福州 350001

潘丹玲，女，副主任醫(yī)師。E-mail： pandanling0909@sina.com 陳小巖，女，教授，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail： fjslyyblk@sina.com

R 738.6

:A

:1001-7399(2017)07-0759-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.012

接受日期：2017-05-17