王 珊，董麗儒，任會(huì)強(qiáng)，劉愛(ài)東，熊艷杰，宋旭東

肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)與K-RAS基因突變狀態(tài)的相關(guān)性分析

王 珊，董麗儒，任會(huì)強(qiáng)，劉愛(ài)東，熊艷杰，宋旭東

目的探討肺腺癌程序性死亡分子-1(programmed death 1, PD-1)、程序性死亡分子配體-1(programmed death ligand 1, PD-L1)蛋白的表達(dá)與K-RAS基因突變的相關(guān)性。方法采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)PD-1、PD-L1蛋白的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)K-RAS基因的突變類型。結(jié)果肺腺癌組織中PD-1、PD-L1的陽(yáng)性率均高于良性病變肺組織(P<0.01)，PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙史、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。36例肺腺癌樣本中發(fā)生K-RAS基因突變者8例(22.2%)，K-RAS基因突變與患者性別、年齡、吸煙史、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無(wú)關(guān)(P>0.05)。相關(guān)分析顯示PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)與K-RAS突變無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)D-1、PD-L1蛋白在肺腺癌中的表達(dá)明顯高于良性病變肺組織，但兩者表達(dá)程度與肺腺癌的臨床病理特征及K-RAS基因突變無(wú)關(guān)。

肺腫瘤；腺癌；PD-1；PD-L1；K-RAS基因突變

肺癌是全球發(fā)病率最高的實(shí)體腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)所占比例最高，NSCLC又包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌。近年，肺癌的靶向治療以及免疫治療已成為臨床分析的熱點(diǎn)。程序性死亡分子-1(programmed death 1, PD-1)是主要表達(dá)在活化T細(xì)胞上的抑制性受體之一，與程序性死亡分子配體-1(programmed death ligand 1, PD-L1)結(jié)合，可顯著抑制T細(xì)胞的活化和增殖。最近，文獻(xiàn)報(bào)道EGFR突變的NSCLC高表達(dá)PD-L1蛋白[1]。本文著重探討肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白的表達(dá)及其與K-RAS基因突變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集河北省唐山市人民醫(yī)院2015年9月～2016年2月及華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院2012年1月～2016年6月接受肺癌根治術(shù)，且組織學(xué)證實(shí)為肺腺癌患者的石蠟標(biāo)本36例。所有患者術(shù)前均未行放、化療，臨床病理資料完整?；颊吣挲g41～76歲，中位年齡61歲。另隨機(jī)收集20例良性病變肺組織作為對(duì)照。

1.2主要試劑兔抗人單克隆抗體PD-1、PD-L1(Abcam公司)，石蠟包埋組織DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京天根公司；K-RAS基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?購(gòu)自北京鑫諾美迪公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化 免疫組化采用EnVision兩步法，石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，梯度乙醇脫蠟至水，高壓修復(fù)后用3%H2O2封閉10 min，滴加一抗PD-1或PD-L1，4 ℃過(guò)夜；取出切片恢復(fù)至室溫，滴加二抗；37 ℃恒溫箱孵育30 min后滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，分化，返藍(lán)，脫水，透明，封固。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按試劑盒說(shuō)明書提取DNA，配制反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系置于Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min，循環(huán)1次，變性94 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 35 s，循環(huán)45次。通過(guò)Bio-Rad CFX Manager分析K-RAS突變結(jié)果。

1.4結(jié)果判斷

1.4.1PD-1結(jié)果判斷 PD-1主要表達(dá)于活化T細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜，呈棕黃色粗顆粒狀。以細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)估，在低倍鏡下觀察整張切片，尋找高密度淋巴細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞中PD-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并求其平均值作為PD-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。以36例肺腺癌中PD-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的均值作為閾值，大于該閾值為PD-1陽(yáng)性，低于該閾值為PD-1陰性[2]。

1.4.2PD-L1結(jié)果判斷 PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜，呈棕黃色粗顆粒狀。采用二級(jí)記分法，按細(xì)胞著色程度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按細(xì)胞陽(yáng)性比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤2%為0分，2%～10%為1分，10%～50%為2分，>50為3分。最后將兩者相乘：得分>3分為陽(yáng)性；≤3分為陰性[3]。

1.4.3K-RAS結(jié)果判斷 確定每個(gè)突變反應(yīng)孔Ct值(CtM)和外控Ct值(CtW)，計(jì)算每個(gè)突變反應(yīng)孔的△Ct(CtM - CtW)值，若△Ct≤8，且同時(shí)滿足CtW<30；即可確定樣本為突變型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)及K-RAS基因突變狀態(tài)與肺腺癌臨床病理特征分析采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系36例肺腺癌中PD-1陽(yáng)性率為50%(18/36)，PD-L1陽(yáng)性率為44.4%(16/36)，良性病變肺組織中PD-1、PD-L1的陽(yáng)性率均為0(0/20)。肺腺癌中PD-1、PD-L1的陽(yáng)性率均高于良性病變肺組織(P<0.05，表2，圖1)。肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙與否、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無(wú)關(guān)(P>0.05，表3)。

表1 K-RAS擴(kuò)增引物序列

表2 PD-1、PD-L1蛋白在肺腺癌及良性病變肺組織中的表達(dá)

表3 PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n=36)

ABC圖1 A.肺腺癌的腫瘤細(xì)胞核質(zhì)比增大,呈腺管樣結(jié)構(gòu)排列;B.肺腺癌中PD-1呈陽(yáng)性,EnVision兩步法;C.肺腺癌中PD-L1呈陽(yáng)性,EnVision兩步法

表4 肺腺癌中K-RAS基因突變檢測(cè)(n=36)

表5 K-RAS基因突變與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n=36)

2.2K-RAS基因突變與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系36例肺腺癌中檢出K-RAS突變8例(表4，圖2)，突變率為22.2%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示K-RAS基因突變與患者性別、年齡、吸煙與否、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P>0.05，表5)。

2.3PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)與K-RAS突變的相關(guān)性分析相關(guān)性分析表明，PD-1蛋白表達(dá)與K-RAS突變無(wú)關(guān)(r=0.134，P>0.05)；PD-L1蛋白表達(dá)與K-RAS突變無(wú)關(guān)(r=-0.075，P>0.05)。

圖2 肺腺癌K-RAS基因突變實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增分析 A.GGT>TGT；B.GGT>AGT；C.GGT>GTT；D.GGT>GAT

3 討論

人PD-1基因定位于染色體2q37.3，編碼免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，多表達(dá)于活化的T細(xì)胞。目前，PD-1的配體被證實(shí)有2個(gè)，分別為PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是PD-1的主要配體，普遍表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞、活化的T細(xì)胞及B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。PD-L1基因定位于染色體的9p24，編碼含有290個(gè)氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白。正常人體中，PD-1與PD-L1結(jié)合，使T細(xì)胞的活化被抑制，具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用[4]。由于正常T細(xì)胞表達(dá)PD-1，PD-L1在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，故現(xiàn)階段文獻(xiàn)報(bào)道PD-L1較多。目前，關(guān)于PD-L1蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系報(bào)道不一致。Song等[5]發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)與肺癌臨床病理特征均無(wú)相關(guān)性。宋燕秋等[6]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明78例肺腺癌組織中PD-L1在女性、非吸煙及Ⅱ～Ⅲ期中的表達(dá)水平高于男性、吸煙者及Ⅰ期患者。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PD-1、PD-L1陽(yáng)性率與患者性別、年齡、吸煙與否、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無(wú)差異。文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論不一致，可能與免疫組化檢測(cè)PD-L1的陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一有關(guān)。Reck等[7]比較抗PD-1的靶向藥Pembrolizumab與鉑類為基礎(chǔ)的化療藥治療PD-L1陽(yáng)性NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)Pembrolizumab組無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯延長(zhǎng)。因此，免疫治療有望給更多NSCLC患者帶來(lái)希望。

K-RAS蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為2.1×104，故也被稱為p21蛋白。K-RAS蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)面，具有內(nèi)在GTP酶活性，K-RAS蛋白通過(guò)與GTP結(jié)合后被活化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。K-RAS基因突變后其編碼的p21蛋白活性降低，失去內(nèi)在GTP酶活性，從而使信號(hào)傳導(dǎo)一直處于激活狀態(tài)，持續(xù)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖，引起細(xì)胞惡變[8]。K-RAS基因突變率在人種之間存在差異，西方NSCLC人群中突變率較高，在肺腺癌中甚至達(dá)30%。亞洲NSCLC人群的突變率為4%～24%[9]。K-RAS基因突變主要發(fā)生于第2外顯子的12及13號(hào)密碼子上，其中12號(hào)密碼子的突變率(92%)明顯高于13號(hào)密碼子(8%)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺腺癌中K-RAS基因突變率為22.2%，均發(fā)生在12號(hào)密碼子，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相符。目前，對(duì)K-RAS基因突變與肺癌臨床病理特征關(guān)系的相關(guān)分析尚未統(tǒng)一。Brcic等[11]分析273例肺腺癌患者的K-RAS基因狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)吸煙者K-RAS突變率高于非吸煙者，K-RAS突變與患者性別、年齡、臨床分期均無(wú)關(guān)。張卉等[12]認(rèn)為K-RAS基因突變與患者性別、年齡、分期、吸煙史無(wú)關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道相符，可能由于亞洲人群肺癌K-RAS突變率較低、樣本量不足導(dǎo)致抽樣有誤差。

目前，針對(duì)K-RAS基因突變患者的治療仍未找到理想靶向藥物。隨著免疫治療的不斷發(fā)展，K-RAS基因突變患者能否從免疫治療中獲益也成為研究的新方向。D’Incecco等[13]在122例NSCLC樣本中評(píng)估PD-1蛋白表達(dá)及K-RAS基因突變狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)PD-1陽(yáng)性與K-RAS突變狀態(tài)顯著相關(guān)，K-RAS基因突變的患者有更高的PD-1蛋白表達(dá)。有學(xué)者通過(guò)分析K-RAS基因突變的肺腺癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)阻斷K-RAS的下游通路可以減少腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。他們認(rèn)為K-RAS所在的MAPK通路對(duì)細(xì)胞表面PD-L1蛋白表達(dá)起主導(dǎo)作用[14]。Ji等[15]結(jié)果顯示PD-1蛋白表達(dá)與K-RAS基因突變呈負(fù)相關(guān)。本組通過(guò)相關(guān)性分析，并未發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1蛋白的表達(dá)與K-RAS突變存在相關(guān)性。

綜上所述，現(xiàn)階段K-RAS基因突變與PD-1、PD-L1表達(dá)的相關(guān)性報(bào)道各異，可能是由于K-RAS基因突變?cè)谌朔N之間的差異；另外，上述報(bào)道均采用免疫組化法檢測(cè)PD-1、PD-L1蛋白的表達(dá)，但目前尚無(wú)統(tǒng)一的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，也造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果之間的差異。因此，對(duì)于K-RAS基因突變與PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性，仍需更深入的分析。

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RelevantresearchofPD-1,PD-L1proteinexpressionandK-RASgenemutationsinlungadenocarcinoma

WANG Shan, DONG Li-ru, REN Hui-qiang, LIU Ai-dong, XIONG Yan-jie, SONG Xu-dong

(DepartmentofPathology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan063000,China)

PurposeTo investigate the association of the PD-1 and PD-L1 protein expression with K-RAS gene mutations in lung adenocarcinoma.MethodsThe protein expression of PD-1 and PD-L1 was detected by immunohistochemical EnVision two-step staining, the K-RAS mutation was examined by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsThe positive rate of PD-1 and PD-L1 was higher in lung adenocarcinoma than benign lung disease (P<0.01). There was no relationship between PD-1 and PD-L1 protein expression with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The K-RAS gene mutations were detectable in 8 patients (22.2%) among 36 lung adenocarcinoma, there was no association between K-RAS gene mutation with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The correction analysis showed that there was no relationship between PD-1 and PD-L1 protein expression with K-RAS mutation (P>0.05).ConclusionThe positive rate of PD-1 and PD-L1 is higher in lung adenocarcinoma than benign lung disease, but there is no relationship among PD-1 and PD-L1 protein expression with its clinal pathological characteristics and K-RAS mutation in lung adenocarcinoma.

lung neoplasm；adenocarcinoma；PD-1；PD-L1；K-RAS gene mutations

時(shí)間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.011.html

2016年河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題研究(361036)

河北省唐山市華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科 063000

王 珊，女，碩士研究生。E-mail: 496874845@qq.com 宋旭東，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: songxd2002@sina.com

R 734.2

:A

:1001-7399(2017)07-0754-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.011

接受日期：2017-05-22