王明娟，周曉慧，劉 超

長鏈非編碼RNA-HOTAIR對子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響

王明娟1，周曉慧2，劉 超3

目的探討長鏈非編碼RNA(lncRNA)-HOTAIR對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為調(diào)控作用的影響。方法收集子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本20例、增生子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本20例、正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本10例，采用RT-PCR檢測lncRNA-HOTAIR在正常子宮內(nèi)膜組織、增生子宮內(nèi)膜組織及各期子宮內(nèi)膜癌組織中的差異表達(dá)；利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將HOTAIR-siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞；分別采用MTT實驗檢測各組細(xì)胞增殖能力、Transwell小室實驗對各組細(xì)胞遷移和侵襲能力進(jìn)行檢測。結(jié)果與正常子宮內(nèi)膜組相比，lncRNA-HOTAIR在各期子宮內(nèi)膜癌組的基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；lncRNA-HOTAIR在單純性增生子宮內(nèi)膜組、不典型性增生子宮內(nèi)膜組的表達(dá)水平，差異無顯著性(P>0.05)。HOTAIR-siRNA靶向抑制組的細(xì)胞增殖水平、侵襲能力與遷移能力顯著低于空白對照組與陰性對照組(P<0.05)。結(jié)論lncRNA-HOTAIR參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展，可能在子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移侵襲中起重要作用。

子宮腫瘤；子宮內(nèi)膜癌；lncRNA-HOTAIR；siRNA；遷移與侵襲

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢[1-3]，嚴(yán)重威脅婦女生命和健康。15%～25%的子宮內(nèi)膜癌患者就診時已經(jīng)為晚期，大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后較差[4]，患者的子宮外轉(zhuǎn)移與其預(yù)后明顯相關(guān)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個極其復(fù)雜的多階段、多基因調(diào)控異常的過程[5]，是癌基因激活與抑癌基因失活共同作用的結(jié)果。長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)紊亂參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，尤其在腫瘤的發(fā)生中起重要作用[6]。HOTAIR是個已知的通過反式作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)的lncRNA，長度為2 158 bp，目前HOTAIR在乳腺癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤的研究中取得一定進(jìn)展，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[7]。本實驗采用RT-PCR、MTT、Transwell小室法旨在探討HOTAIR與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移侵襲的相關(guān)性，對HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌中的作用進(jìn)行初步分析，為子宮內(nèi)膜癌的治療及預(yù)后評價提供實驗依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1材料收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科2013年1月～2014年12月子宮組織50例，分別為正常子宮內(nèi)膜組織10例、單純性增生子宮內(nèi)膜組織10例、不典型增生子宮內(nèi)膜組織10例及各期子宮內(nèi)膜癌組織20例(其中子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期10例、子宮內(nèi)膜癌Ⅱ期5例、子宮內(nèi)膜癌Ⅲ期5例)。患者均簽署知情同意書，子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未接受放、化療或性激素治療，所有病例均無其他惡性腫瘤。將新鮮組織于組織離體后30 min內(nèi)取材，置于經(jīng)RNA酶滅活的無菌凍存管中，液氮速凍4 h，-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa購于凱基生物公司，RT-PCR引物由上海生物公司合成；RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol均購自 Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，購自大連寶生物公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；MTT購自Sigma公司；Transwell小室購自Corning公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2總RNA提取及RT-PCR檢測 采用Trizol法提取RNA，提取細(xì)胞中的RNA時，細(xì)胞(1～5)×107個加入1 mL Trizol。提取組織樣本RNA時，取-80 ℃保存的新鮮組織100 mg，研磨后加入1 mL Trizol，再次研磨混勻后提取RNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用核酸定量儀測定其純度和濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR特異性擴增，檢測lncRNA-HOTAIR和內(nèi)參GAPDH的基因表達(dá)。HOTAIR引物序列：上游5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3′，下游5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA-3′，下游5′-GGTCATTGATGGCAACAATAT-3′。反應(yīng)條件為預(yù)變性：94 ℃ 2 min，變性：94 ℃ 30 s，退火：62 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 20 s，延伸：10 ℃ 10 min，30個循環(huán)。應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶光密度與GAPDH條帶光密度的比值，作為各目的基因表達(dá)的相對水平。

1.3.3特異干擾RNA(siRNA)抑制lncRNA-HOTAIR的表達(dá) 應(yīng)用HOTAIR特異性siRNA(上海吉瑪公司設(shè)計合成)的序列信息如下。siRNA1：正義5′-GCACAGAGCAACUCUAUAATT-3′，反義5′-UUAU AGAGUUGCUCUGUGCTT-3′；siRNA2：正義5′-GAGG CGCUAAUUAAUUGAUTT-3，反義5′-AUCAAUUAAU UAGCGCCUCTT-3′；siRNA3：正義5′-GCUAAGGA AAGAUCCAAAUTT-3′，反義5′-AUUUGGAUCUUUC CUUAGCTT-3′；陰性對照：正義5′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′，反義5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。利用Lipofectamine 2000將siRNA轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞，細(xì)胞密度每毫升1×105個。(1)設(shè)空白對照組：子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa；(2)陰性對照組：在Ishikawa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空白序列；(3)實驗組：在Ishikawa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染特異HOTAIR-siRNA序列siRNA1、siRNA2、siRNA3的終濃度50 nmol/L，轉(zhuǎn)染48 h后采用RT-PCR檢測siRNA對HOTAIR的抑制率。

1.3.4MTT法檢測細(xì)胞的增殖水平 分別取200 μL的空白對照組、陰性對照組、實驗組中HOTAIR-siRNA3細(xì)胞，接種至96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。48 h終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h每孔需加入20 μL MTT,使其終濃度為5 mg/mL。培養(yǎng)完畢后吸除孔內(nèi)液體，并加入200 μL DMSO。用酶標(biāo)儀測定在570、630 nm波長下的光密度值(OD)，其中以O(shè)D630作校準(zhǔn)；細(xì)胞活力用OD570表示。每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5細(xì)胞體外遷移和侵襲實驗 侵襲實驗：用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel，每孔使用100 mL Matrigel包被Transwell小室。分別取空白對照組、陰性對照組、HOTAIR-siRNA3組各200 μL細(xì)胞懸液(含1%胎牛血清 DMEM)加入Transwell小室的上室中(細(xì)胞密度為每毫升1×105個)，將含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液500 μL加入下室中，每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。將Transwell小室板轉(zhuǎn)移至37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出Transwell小室，用干凈的棉簽擦去上室表面的細(xì)胞及Matrigel，PBS沖洗2次，用甲醇固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，純水清洗，顯微鏡下計數(shù)至少5個高倍視野穿膜的細(xì)胞，計算每個視野平均穿膜細(xì)胞數(shù)，作為評價細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。遷移實驗：除不在Transwell小室中包被Matrigel，其余步驟同侵襲實驗。

2 結(jié)果

2.1HOTAIR在正常、增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與正常子宮內(nèi)膜組相比，單純性子宮內(nèi)膜增生組、不典型子宮內(nèi)膜增生組中HOTAIR基因的表達(dá)水平，差異均無顯著性(P>0.05)。與正常子宮內(nèi)膜組相比，子宮內(nèi)膜癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中HOTAIR基因的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，提示HOTAIR的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)(圖1)。

圖1 HOTAIR在正常、增生子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)

1.Marker；2.正常子宮內(nèi)膜；3.單純性子宮內(nèi)膜增生；4.不典型子宮內(nèi)膜增生；5.子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期；6.子宮內(nèi)膜癌Ⅱ期；7.子宮內(nèi)膜癌Ⅲ期

2.2特異siRNA抑制lncRNA-HOTAIR的表達(dá)分別收集空白細(xì)胞、陰性對照、HOTAIR-siRNA1、HOTAIR-siRNA2、HOTAIR-siRNA3各組細(xì)胞，提取總RNA。采用RT-PCR法檢測特異siRNA對HOTAIR基因表達(dá)的抑制率。結(jié)果顯示：與空白細(xì)胞組比較，陰性對照組HOTAIR基因的表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA1、HOTAIR-siRNA2、HOTAIR-siRNA3組中HOTAIR基因的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；通過比較3組中HOTAIR基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，HOTAIR-siRNA1組與HOTAIR-siRNA2組基因的表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)；與HOTAIR-siRNA1組相比，HOTAIR-siRNA3組基因的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與HOTAIR-siRNA2組相比，HOTAIR-siRNA3組基因的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，提示HOTAIR-siRNA3干擾性最強，本組將其作為后續(xù)實驗的干擾條件(圖2)。

1.Marker；2.HOTAIR-siRNA1；3.HOTAIR-siRNA2；4.HOTAIR-siRNA3；5.陰性對照；6.空白對照

2.3MTT法檢測各組細(xì)胞增殖水平MTT實驗結(jié)果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組細(xì)胞的增殖能力無明顯改變(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA3組細(xì)胞的增殖能力顯著減弱(P<0.05，圖3)。

2.4Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力

2.4.1細(xì)胞侵襲實驗 與空白對照組比較，陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)差異無顯著性(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA3組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01，圖4、5)。

2.4.2細(xì)胞遷移實驗 與空白對照組比較，陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)；與陰性對照組比較，HOTAIR-siRNA3組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01，圖6、7)。

圖3 比較各組細(xì)胞增殖水平與陰性對照組比較，*P<0.05

ABC圖4 細(xì)胞侵襲實驗:A.空白對照組;B.陰性對照組;C.HO-TAIR-siRNA3組

圖5 HOTAIR-siRNA對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力的影響與陰性對照組比較，*P<0.01

圖6細(xì)胞遷移實驗：A.空白對照組；B.陰性對照組；C.HOTAIR-siRNA3組

圖7 HOTAIR-siRNA對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移能力的影響與陰性對照組比較，*P<0.01

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是婦科腫瘤最常見的惡性腫瘤，位居女性生殖道惡性腫瘤的首位，主要原因可能是高級別腫瘤(如漿液性腺癌)、晚期和老年患者的增長[9]。由于大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌具有基因突變，因此從分子層面上探索子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制及與子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移侵襲的分子機制，將為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后評估和基因治療尋找新的靶點。

lncRNA是長度大于200 nt的RNA，其本身不具有編碼蛋白的功能，以RNA的形式從多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)。lncRNA可通過RNA與蛋白質(zhì)的相互作用、RNA與DNA、RNA與RNA的相互作用方式，從表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因表達(dá)[10]。

近年關(guān)于lncRNA功能的研究進(jìn)展迅速，但絕大部分lncRNA的功能尚未明確[11]。只有少部分 lncRNA的生物學(xué)功能得到驗證，盡管文獻(xiàn)報道較少，但lncRNA在惡性腫瘤等人類疾病的治療和診斷中具有重要的潛在應(yīng)用前景。

lncRNA-HOTAIR位于人類12號染色體HOHC基因座，屬于典型的反義lncRNA，主要通過反式作用沉默染色質(zhì)。大量研究證實，HOTAIR在乳腺癌、食管癌、肝癌等多種實體瘤中均高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)、不良預(yù)后等均密切相關(guān)[7]。Gucta等[12]證實HOTAIR在原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中均顯著表達(dá)，且在轉(zhuǎn)移灶中HOTAIR表達(dá)水平高出正常上皮組織200～2 000倍，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，雌二醇可誘導(dǎo)HOTAIR的轉(zhuǎn)錄，提示HOTAIR轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域存在雌二醇的功能反應(yīng)元件。體外實驗證實，HOTAIR在食管鱗癌細(xì)胞系中KYSE30細(xì)胞株的表達(dá)水平較高，采用siRNA技術(shù)敲低HOTAIR，可顯著降低KYSE30細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力，并顯著增加細(xì)胞凋亡率。HOTAIR已被發(fā)現(xiàn)[13]在多種腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)VEGF、MMP-9蛋白及EMT相關(guān)基因，增強腫瘤生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移， HOTAIR缺失可減緩細(xì)胞增殖，降低MMP及VEGF蛋白表達(dá)。本組探討正常子宮內(nèi)膜、增生子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織中HOTAIR的表達(dá)，結(jié)果顯示：與正常子宮內(nèi)膜組比較，單純性子宮內(nèi)膜增生組、不典型子宮內(nèi)膜增生組中HOTAIR基因的表達(dá)水平差異均無顯著性(P>0.05)；與正常子宮內(nèi)膜組比較，子宮內(nèi)膜癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中HOTAIR基因的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，表明lncRNA-HOTAIR的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本實驗通過特異siRNA靶向抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)，采用MTT細(xì)胞增殖實驗、Transwell小室實驗，分析子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移侵襲的相關(guān)性。結(jié)果顯示：通過轉(zhuǎn)染HOTAIR-siRNA，能夠有效抑制HOTAIR在細(xì)胞中的表達(dá)水平。在HOTAIR-siRNA靶向抑制組中，MTT實驗顯示細(xì)胞增殖能力明顯下降；Transwell實驗表明，HOTAIR表達(dá)被抑制后，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降，推測HOTAIR的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

綜上所述，HOTAIR的高表達(dá)將促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，可能與子宮內(nèi)膜癌的不良預(yù)后有關(guān)，提示其具有高度的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。因此，HOTAIR有望成為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后評價的生物學(xué)標(biāo)志物及基因治療的新靶點。

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Influenceoflongchainnon-codingRNA(lncRNA)-HOTAIRonmigrationandinvasionabilityofendometrialcancer

WANG Ming-juan1, ZHOU Xiao-hui2, LIU Chao3

(1MorphologyExperimentalCenter,2DepartmentofBiochemistry,BasicMedicalCollege,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China;3DepartmentofCardiovascular,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China)

PurposeTo investigate the influence of long chain non-coding RNA (lncRNA)-HOTAIR on endometrial cancer cell proliferation, invasion, metastasis and other biological behaviour.Methods20 cases of endometrial carcinoma tissue specimen, 20 cases of hyperplasia tissue sample and 10 cases of normal tissue specimen were collected. Difference expression of lncRNA-HOTAIR in normal endometrium, hyperplasia endometrium tissue and endometrial carcinoma tissue at all periods were detected with RT-PCR assay. HOTAIR-siRNA transfection into Ishikawa cells was utilized with Lipofectamine 2000. MTT experiment was used to detected the proliferation ability of cells in all groups. Transwell chamber experiment was used to test the migration and invasion ability of cells in all groups.ResultsThe gene expression level of of lncRNA-HOTAIR in endometrial carcinoma group at all stages was prominently increased compared with normal endometrium group (P<0.05). The expression level of lncRNA-HOTAIR in simple hyperplasia endometrium group and atypical hyperplasia endometrial group was not significantly different (P>0.05). Cell proliferation, invasion ability and migration ability of HOTAIR-siRNA targeting suppression group were lower than the blank control group and the negative control group significantly (P<0.05).ConclusionlncRNA-HOTAIR may involved in occurrence and development of endometrial cancer, which may play an important role in the aggression and metastasis of endometrial cancer.

endometrial neoplasm； endometrial cancer； lncRNA-HOTAIR； siRNA； migration and invasion

時間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.007.html

河北省衛(wèi)生計生委(ZD20140070)

1承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗中心、2生化教研室，承德 067000

3承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科，承德 067000

王明娟，女，碩士，實驗師。E-mail： 1390027337@qq.com

R 737.33

:A

:1001-7399(2017)07-0737-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.007

接受日期：2017-05-27