章龍玉，魏兆蓮，徐福霞

自噬基因LC3在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及其意義

章龍玉1，魏兆蓮2，徐福霞1

目的探討細(xì)胞自噬狀態(tài)與子宮內(nèi)膜異位癥之間的關(guān)系及其意義。方法對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(n=31)及正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(n=31)行原代培養(yǎng)，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定；應(yīng)用透射電鏡觀察組織中細(xì)胞自噬泡超微結(jié)構(gòu)變化；采用RT-PCR、Western blot法檢測(cè)LC3 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果透射電鏡結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞的自噬泡數(shù)目較少。RT-PCR及Western blot法結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜異位癥患者在位及異位內(nèi)膜的LC3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯低于正常子宮內(nèi)膜(P<0.05)。子宮內(nèi)膜異位癥患者在位與異位內(nèi)膜的LC3 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而異位內(nèi)膜的LC3蛋白表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜(P<0.05)。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的自噬活性降低，自噬可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。

細(xì)胞自噬；子宮內(nèi)膜異位癥；LC3

子宮內(nèi)膜基質(zhì)和腺體出現(xiàn)在子宮體以外的部位稱為子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMT)，由具有生長(zhǎng)功能的異位內(nèi)膜所致。因EMT導(dǎo)致的痛經(jīng)、不孕等嚴(yán)重影響育齡婦女的健康，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。EMT與腫瘤疾病有許多共性，如轉(zhuǎn)移、種植、復(fù)發(fā)等。已明確細(xì)胞自噬的活性在多種腫瘤疾病中有所改變[1-2]。細(xì)胞自噬的形成與多種自噬因子有關(guān)，LC3是重要的細(xì)胞自噬因子[3]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)EMT在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞的自噬泡超微結(jié)構(gòu)及LC3與EMT的相關(guān)性報(bào)道較少。本文著重探討細(xì)胞自噬狀態(tài)與EMT之間的關(guān)系及其意義，提高人們對(duì)其的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科EMT合并單側(cè)或雙側(cè)巧克力囊腫并行巧囊剝除術(shù)的患者31例，平均年齡(32.48±4.36)歲。術(shù)前用一次性內(nèi)膜吸引器吸取少量子宮內(nèi)膜，術(shù)后立即分離巧囊囊壁，30 min內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)操作。另收集因輸卵管不通不孕或正常女性患者合計(jì)31例正常子宮內(nèi)膜，患者平均年齡(32.39±2.64)歲。女性行輸卵管通液術(shù)或造影術(shù)前用一次性內(nèi)膜吸引器吸取少量子宮內(nèi)膜，處理方法同上。所有患者均在月經(jīng)干凈后3～7天進(jìn)行手術(shù)，選取增生期的子宮內(nèi)膜，由病理醫(yī)師診斷確診。所有患者月經(jīng)正常，均無內(nèi)科合并癥，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未行激素類藥物治療，所有患者在采集標(biāo)本前均被告知，并簽署知情同意書。

1.2主要試劑膠原酶Ⅰ購自美國(guó)Sigma公司；vimentin抗體購自上海科敏公司；CK抗體購自北京博奧森公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；LC3抗體(SC-271625)購自美國(guó)Santa Cruz公司；SP試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3方法

1.3.1子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 將選取好的子宮內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織用D-hanks反復(fù)沖洗后，剪碎組織至大小1 mm3。根據(jù)文獻(xiàn)[4]提供的方法分離EMT在位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定培養(yǎng)獲得的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，對(duì)于一抗的稀釋，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)后采用Anti-vimentin：1 ∶200、Anti-CK19：1 ∶200。次日室溫條件下添加二抗(生物素標(biāo)記小鼠抗人IgG)，DBA顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固，于80 ℃烤箱烤干。分離純化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞以備后用。

1.3.2透射電鏡樣品制備 將剛離體的組織切割至1 mm3大小，經(jīng)2.5%戊二醛固定，脫水，包埋，固化，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察拍片。

1.3.3RT-PCR檢測(cè)LC3 mRNA的表達(dá)水平 采用Trizol提取液抽提細(xì)胞中的RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA中的信使RNA(mRNA)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取cDNA標(biāo)本按下列比例配置PCR反應(yīng)體系：2×Goldstar混合物10 μL；上游引物：0.4 μL(10 μmol/L)；下游引物：0.4 uL(10 μmol/L)；模板DNA 2 μL；無RNA酶水7.2 μL。按照下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。得到擴(kuò)增曲線后讀取Ct值，計(jì)算mRNA含量。引物如下：GAPDH上游5′-GCCGCAT CTTCTTTTGCGTC-3′，下游5′-TACGACCAAATCCGT TGACTCC-3′；LC3上游5′-TCAGACCGGCCTTTCAA GCA-3′，下游 5′-CTCGATGATCACCGGGATTTTG-3′；以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.4Western blot檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)水平 將原代培養(yǎng)的細(xì)胞懸液1 000 r/min×5 min，加入含有1 μmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，進(jìn)行12 000 r/ min×5 min。細(xì)胞總蛋白于上清液內(nèi)。取上清，蛋白定量后分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳：SDS-PAGE凝膠配制、樣品處理、上樣與電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，使用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(圖1)及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞按照上述的分離純化方法，置于顯微鏡下觀察并攝片?？梢婄R下細(xì)胞排列不規(guī)則，呈中間粗大、兩邊細(xì)小的紡錘體，排列無規(guī)則，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

2.2子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)的鑒定子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞鏡下大部分呈紡錘體，少部分呈三角形，細(xì)胞邊緣不清晰，排列無規(guī)則。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞CK19呈陰性(圖2A)，vimentin呈陽性(圖2B)，其細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。隨機(jī)取5個(gè)視野(×100)，vimentin著色細(xì)胞即基質(zhì)細(xì)胞比例為95%以上。

2.3正常子宮內(nèi)膜組織和EMT在位及異位內(nèi)膜組織中細(xì)胞自噬泡超微結(jié)構(gòu)的變化正常子宮內(nèi)膜組織獲得5例切片，EMT在位及異位內(nèi)膜組分別獲得5例切片。結(jié)果顯示：EMT在位及異位內(nèi)膜中自噬溶酶體的數(shù)量無明顯差別，其自噬溶酶體的數(shù)量明顯少于正常子宮內(nèi)膜組織。自噬體表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)游離的單層或雙層膜結(jié)構(gòu)包繞胞質(zhì)或損傷細(xì)胞器形成的囊泡狀結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.4LC3mRNA在正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和EMT在位、異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)LC3 mRNA在EMT在位及異位內(nèi)膜組與正常子宮內(nèi)膜組的表達(dá)。結(jié)果顯示：LC3 mRNA在EMT在位及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)均低于正常子宮內(nèi)膜組(F=4.438，P=0.015)。EMT在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的LC3 mRNA與正常子宮內(nèi)膜組相比其表達(dá)下調(diào)(0.435±0.227，P=0.013)，EMT異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)量與正常子宮內(nèi)膜組相比其表達(dá)也下調(diào)(0.429±0.303，P=0.011)，但EMT在位及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)量差異無顯著性(1.282±0.534，P=0.949)。提示EMT不管在位及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常子宮內(nèi)膜組(圖4)。

2.5LC3蛋白在正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和EMT在位、異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)運(yùn)用Western blot法檢測(cè)LC3蛋白在EMT在位及異位內(nèi)膜組與正常子宮內(nèi)膜組中的表達(dá)。結(jié)果顯示：LC3蛋白在EMT在位及異位內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)均低于正常子宮內(nèi)膜組(P=0.000)。EMT在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的LC3蛋白與正常子宮內(nèi)膜組相比其表達(dá)下調(diào)(0.242±0.08，0.440±0.08；P=0.000)。EMT異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)量比正常子宮內(nèi)膜組相比其表達(dá)也下調(diào)(0.309±0.09，P=0.000)；EMT異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)量明顯高于在位內(nèi)膜組(P=0.003)，與RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符(圖5)。

①②A②B③A③B③C

圖1正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞圖2子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，SP法：A.CK19呈陰性；B.vimentin呈陽性圖3A.正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬泡超微結(jié)構(gòu)；B.EMT中在位內(nèi)膜細(xì)胞自噬泡超微結(jié)構(gòu)；C. EMT中異位內(nèi)膜細(xì)胞自噬泡超微結(jié)構(gòu)

圖4 EMT在位及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞及正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中LC3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

育齡期婦女發(fā)生EMT較為常見，其屬于良性疾病，但生物學(xué)行為與惡性腫瘤有相似之處，如種植、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等。目前，EMT的發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說，以經(jīng)血逆流和內(nèi)膜種植學(xué)說最為經(jīng)典，但該學(xué)說無法解釋部分經(jīng)血逆流婦女為何未患EMT。研究表明[5]：肉眼觀察EMT患者的在位子宮內(nèi)膜與非EMT婦女的子宮內(nèi)膜無明顯差異，但在超微結(jié)構(gòu)、免疫特性和分子活性等方面可能差異有顯著性。EMT患者的在位子宮內(nèi)膜的某些特性如黏附性、侵襲性、刺激形成血管的能力均較強(qiáng)，更易于異地生長(zhǎng)種植。近年郎景和院士提出“在位內(nèi)膜決定論”[6]，認(rèn)為在位子宮內(nèi)膜的生物學(xué)異常是決定因素，周圍微環(huán)境則是EMT發(fā)生的影響因素。

圖5 EMT在位、異位內(nèi)膜組及正常子宮內(nèi)膜組中LC3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量

自噬是指在真核細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)自我清除周轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬參與多種病理過程，可能與心肌缺血再灌注、神經(jīng)退行性疾病、肥胖癥、腎臟疾病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。自噬與腫瘤的相關(guān)性分析是近年分析地?zé)狳c(diǎn)。環(huán)境因素可影響自噬活性，同時(shí)諸多的信號(hào)通路也對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)控，如依賴mTOR信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、磷酸腺苷激活的蛋白激酶信號(hào)通路以及非依賴mTOR的信號(hào)通路等。自噬水平能夠被一些癌基因抑制，如AKT1、PI3K、BCL-2家族中的抗凋亡蛋白；同時(shí)自噬又能夠被多種抑癌基因激活，如LKB1/STK11、DAPK1、PTEN等。

LC3是細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白，定位于前自噬泡及自噬泡表面，是自噬泡膜的標(biāo)志物。LC3即為ATG8，而ATG8同系物是C末端的延伸形式，經(jīng)ATG4半胱氨酸蛋白酶降解后導(dǎo)致C-末端甘氨酸可以綴合到磷脂酰乙醇胺上。ATG8與磷脂酰乙醇胺的共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致LC3-II結(jié)合到自噬體膜上，有利于自噬體的伸展。在酵母中只存在單一的ATG8蛋白，但哺乳動(dòng)物至少有7個(gè)ATG8家族成員，如LC3A-C中存在LC3A的2種異構(gòu)體即GABARAP和GABARAPL1-2[3]。LC3和GABARAP亞家族成員均可結(jié)合至自噬體膜上[7-8]，基因敲除的研究表明，這兩個(gè)亞族有獨(dú)特的作用且均為自噬體形成所必需。LC3的同系物可結(jié)合于自噬體膜的內(nèi)表面及外表面，外表面的部分被ATG4清除，而內(nèi)表面的部分不會(huì)被清除而是與貨物一起降解。LC3/GABARAP蛋白質(zhì)可以招募各種蛋白質(zhì)。

自噬對(duì)腫瘤的影響亦有不同。自噬活性的提高可能參與人肝癌細(xì)胞的發(fā)展，自噬蛋白LC3B的表達(dá)可能是肝細(xì)胞癌進(jìn)展和預(yù)后不良的潛在標(biāo)志物[9]。LC3的表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌的臨床侵襲性行為，如淋巴結(jié)及淋巴管轉(zhuǎn)移率增高和高的病理分期，抑制自噬可部分逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥[10]。由于EMT與腫瘤有相似的生物學(xué)行為，故近年來關(guān)于自噬與EMT的報(bào)道愈加增多。Ruiz等[11]在EMT的小鼠模型中，應(yīng)用細(xì)胞自噬抑制劑羥氯喹可以減弱人類子宮內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)膜T-HESC細(xì)胞的體外生存能力，同時(shí)羥氯喹可以減少內(nèi)膜異位病灶的數(shù)目和破壞病灶的組織病理學(xué)，升高腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞和干擾素γ誘導(dǎo)蛋白趨化因子的水平，EMT誘導(dǎo)的小鼠子宮角中LC3B蛋白表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，從而證明自噬在EMT的在位及異位內(nèi)膜中表達(dá)失衡。Allavena等[12]證實(shí)自噬相關(guān)基因ATG14、BECN1、ATG7和LC3B的mRNA在卵巢EMT患者的異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平增高，子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞對(duì)凋亡和持續(xù)氧化應(yīng)激的易感性降低可能有利于自噬。國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道：LC3 mRNA在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)低于正常內(nèi)膜組織；異位內(nèi)膜組織與在位內(nèi)膜組織相比，其表達(dá)明顯下調(diào)，但在位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜組間表達(dá)無明顯差異[13]。本實(shí)驗(yàn)在EMT內(nèi)膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)水平發(fā)現(xiàn)，其在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞的自噬活性減弱，同時(shí)在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞的LC3 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，與報(bào)道不完全一致，可能由于上述實(shí)驗(yàn)用的是內(nèi)膜組織，而本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的是子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，因而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更加準(zhǔn)確。抑制哺乳動(dòng)物mTOR蛋白可以增加卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫異位內(nèi)膜的自噬活性，哺乳動(dòng)物mTOR靶蛋白異?；钚詫?dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬的改變，這與異常凋亡相關(guān)[14]。在體外培養(yǎng)的EMT細(xì)胞系，苗勒管抑制物可以抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)自噬與凋亡的發(fā)生[15]。

本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞原代培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)、透射電鏡、RT-PCR、Western blot等技術(shù)系統(tǒng)的分析細(xì)胞自噬與EMT的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)原代細(xì)胞培養(yǎng)，并鑒定。透射電鏡下觀察超薄切片，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，EMT在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞中較少出現(xiàn)自噬體，提示EMT組織中的細(xì)胞自噬活動(dòng)較少。EMT在位及異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，與RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。綜上所述，自噬可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生，但其確切的機(jī)制有待深入探討。

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ExpressionandclinicalsignificanceofautophagygeneLC3inendometriosis

ZHANG Long-yu1, WEI Zhao-lian2, XU Fu-xia1

(1DepartmentofObstetricsandGynecology,AnhuiNo.2ProvincePeople’sHospital,Hefei230011,China;2ReproductiveofCenter,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

PurposeTo study the relationship between autophagy and endometriosis, and its significance.MethodsThe eutopic and ectopic endometrial stromal cells from patients with endometriosis (n=31) and normal endometrial stromal cells (n=31) were cultured primarily and identified by immunocytochemistry. The ultrastructural changes of autophagic vacuoles were observed by transmission electron microscopy (TEM). RT-PCR and Western blot methods were used to detect LC3 mRNA and protein expression in endometrial cells of endometriosis patients.ResultsTEM analysis showed the number of autophagic vacuoles of eutopic and ectopic endometrial cells was fewer. RT-PCR and Western blot analysis showed that the expression of LC3 mRNA and protein in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis was significantly lower than that of the normal endometrial stromal cells (P<0.05). There was no significant difference in the expression of LC3 mRNA between eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis (P>0.05), but the expression of LC3 protein in ectopic endometrium was higher than that in eutopic endometrium of patients with endometriosis (P<0.05).ConclusionAutophagy activity is downregulated in eutopic and ectopic endometrial stromal cells with endometrosis. Autophagy may be involved in the pathogenesis of endometriosis.

autophagy； endometriosis； LC3

時(shí)間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.006.html

1安徽省第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 2300112安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，合肥 230032

章龍玉，女，碩士，醫(yī)師。E-mail: zhanglongyu8@126.com 魏兆蓮，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: weizhaolian_1@126.com

R 711

:A

:1001-7399(2017)07-0732-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.006

接受日期：2017-05-20