鮑合剛，肖 亮，孟 剛，王岳君，王 芬，金問(wèn)森

涎腺腺樣囊性癌中HIF-1α和BCL-2的表達(dá)及意義

鮑合剛1，肖 亮1，孟 剛2，王岳君3，王 芬1，金問(wèn)森1

目的分析涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)中HIF-1α和BCL-2的表達(dá)水平，探討兩者之間表達(dá)的相關(guān)性及與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法檢測(cè)56例SACC中HIF-1α和BCL-2的表達(dá)，并分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果SACC中HIF-1α的陽(yáng)性率為64.3%，其表達(dá)水平與腫瘤TNM分期及來(lái)源腺體呈明顯相關(guān)(P<0.05)。SACC中BCL-2的陽(yáng)性率為98.2%，其表達(dá)水平與HIF-1α呈正相關(guān)(P<0.05)，且HIF-1α與腫瘤TNM分期之間的相關(guān)性依賴于BCL-2的強(qiáng)表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論高表達(dá)的HIF-1α和BCL-2可能影響SACC的分期。

涎腺腫瘤；腺樣囊性癌；HIF-1α；BCL-2；免疫組織化學(xué)

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是發(fā)生于唾液腺的惡性腫瘤，具有生長(zhǎng)緩慢、易復(fù)發(fā)、早期可出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，占頭頸部惡性腫瘤的3%～5%[1]。在絕大多數(shù)的實(shí)體腫瘤內(nèi)存在缺氧微環(huán)境，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)可在缺氧狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)，與HIF-1β結(jié)合后，促進(jìn)下游100種以上的基因轉(zhuǎn)錄，其中包括多種與糖酵解和抗凋亡等相關(guān)的基因，從而加速腫瘤組織的轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)，并對(duì)治療產(chǎn)生抵抗作用[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]，在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等多種腫瘤組織中HIF-1α有穩(wěn)定表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。目前，HIF-1α在SACC中的表達(dá)以及與臨床病理特征的關(guān)系仍存在較大的爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)56例SACC中HIF-1α、BCL-2的表達(dá)，探討兩者的相關(guān)性及其意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2004～2014年存檔的SACC患者手術(shù)切除標(biāo)本56例，其中男性16例，女性40例，年齡16～74歲，中位年齡48歲，其他病理特點(diǎn)及臨床分期詳見(jiàn)表1。

1.2試劑與方法免疫組化采用SP法染色，兔抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人BCL-2單克隆抗體、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟組織塊經(jīng)4 μm厚連續(xù)切片，依次脫蠟、水化，檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)高壓5 min修復(fù)抗原，冷卻至室溫后，3%過(guò)氧化氫浸泡10 min。免疫組化操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，HIF-1α和BCL-2一抗?jié)舛确謩e為1 ∶100和1 ∶200，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.3結(jié)果判定以半定量積分法進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)果判斷[6]。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。200倍鏡下每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：<10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。半定量免疫反應(yīng)積分(immunoreactive score, IRS)為染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積：0～2分為無(wú)表達(dá)，3～4分為弱表達(dá)，6～8分為中表達(dá)，9～12分為強(qiáng)表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，HIF-1α、BCL-2表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性采用非參數(shù)的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行分析，通過(guò)線性回歸分析HIF-1α和BCL-2之間的相關(guān)性。另外，以BCL-2表達(dá)水平進(jìn)行分層，采用Wilcoxon檢驗(yàn)分析BCL-2的不同表達(dá)對(duì)HIF-1α與SACC臨床病理特征的相關(guān)性影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1組織學(xué)特征56例SACC依據(jù)腫瘤病理亞型分為：篩狀型25例(44.6%)、管狀型22例(39.3%)和實(shí)體型9例(16.1%)，發(fā)生于小腺體35例(62.5%)、大腺體21例(37.5%)，腫瘤無(wú)包膜形成，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。管狀型由內(nèi)側(cè)的立方狀細(xì)胞和外側(cè)的梭形細(xì)胞構(gòu)成散在或相互吻合的小管構(gòu)成。實(shí)體型主要為橢圓形呈肌上皮細(xì)胞分化的腫瘤細(xì)胞圍成實(shí)性細(xì)胞巢或?qū)拵罱Y(jié)構(gòu)。篩狀型為最常見(jiàn)的典型結(jié)構(gòu)，由形態(tài)單一的梭形細(xì)胞組成的細(xì)胞巢或條索環(huán)繞的多個(gè)假囊腔樣篩孔呈同心圓排列，似藕的斷面，篩孔大小不等，其間散在由立方狀細(xì)胞組成的小管狀結(jié)構(gòu)。

圖1HIF-1α在SACC中的表達(dá)，SP法：A.弱表達(dá)(管狀型)，B.中等表達(dá)(管狀型)，C.強(qiáng)表達(dá)(篩狀型)圖2BCL-2在SACC中的表達(dá)，SP法： A.弱表達(dá)(實(shí)體型)，B.中等表達(dá)(管狀型)，C.強(qiáng)表達(dá)(管狀型)

2.2HIF-1α、BCL-2在SACC中的表達(dá)HIF-1α在SACC中的表達(dá)主要定位于胞質(zhì)和胞核中，呈棕黃色或深棕色顆粒，癌旁正常的腺體組織則未被染色，陽(yáng)性率為64.3%(36例)，其中HIF-1α弱表達(dá)為15例(26.8%)，中表達(dá)為9例(16.1%)，強(qiáng)表達(dá)為12例(21.4%)(圖1)。BCL-2在SACC中的表達(dá)主要定位于胞質(zhì)和胞膜中，呈棕黃色或深棕色顆粒，癌旁正常的腺體組織則未被染色，陽(yáng)性率為98.2%(55例)，其中弱表達(dá)為2例(3.6%)，中表達(dá)為9例(16.1%)，強(qiáng)表達(dá)為44例(78.6%)(圖2)。

2.3HIF-1α和BCL-2與SACC臨床病理特征的關(guān)系HIF-1α的表達(dá)與SACC的臨床分期(TNM分期)、來(lái)源的腺體呈顯著相關(guān)，與患者性別、年齡、神經(jīng)侵犯以及腫瘤病理亞型無(wú)關(guān)(表1)。BCL-2的表達(dá)與SACC臨床病理特征無(wú)關(guān)(表1)，但與HIF-1α的表達(dá)水平存在顯著相關(guān)(圖3)。

圖3 HIF-1α和BCL-2的相關(guān)性

散點(diǎn)代表同一標(biāo)本HIF-1α和BCL-2的IRS，兩種蛋白表達(dá)的IRS呈顯著相關(guān)(β=0.236，P<0.05)，回歸方程：Y=0.36+0.48X(r=0.33，P=0.013)

2.4BCL-2、HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性采用Wilcoxon檢驗(yàn)BCL-2表達(dá)水平分層，分析BCL-2對(duì)HIF-1α和臨床分期相關(guān)性的影響。結(jié)果顯示，在BCL-2強(qiáng)表達(dá)的SACC中，HIF-1α與臨床分期具有明顯相關(guān)性(Z=2.43，P<0.05)；而在非強(qiáng)表達(dá)BCL-2的腫瘤患者標(biāo)本中，HIF-1α與臨床分期無(wú)顯著相關(guān)性(Z=0.33，P>0.05)。

表1 HIF-1α和BCL-2的表達(dá)與SACC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

**P<0.01,*P<0.05

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，SACC好發(fā)于女性且發(fā)病年齡跨度較大，形成神經(jīng)侵犯的比例為20%～80%，發(fā)生于小腺體多見(jiàn)。本組收集病例符合SACC的上述特點(diǎn)，具有一定的代表性。

在實(shí)體腫瘤中，由于腫瘤組織的快速生長(zhǎng)，常會(huì)在外周富血氧區(qū)域和中央壞死區(qū)之間形成O2濃度<5%的缺氧細(xì)胞層，這些細(xì)胞對(duì)放、化療具有明顯的抵抗作用，是腫瘤復(fù)發(fā)、再生長(zhǎng)的重要來(lái)源，其中HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)是缺氧細(xì)胞產(chǎn)生治療抵抗作用的重要因素之一[9]。研究表明，實(shí)體腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、療效以及患者的預(yù)后密切相關(guān)[10]。然而，SACC中是否存在HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)，以及與臨床病理特征間的相關(guān)性，文獻(xiàn)報(bào)道尚存在較大差異。早期文獻(xiàn)報(bào)道[11]，HIF-1α在涎腺腫瘤中表達(dá)缺失，2012年Costa等[12]在26例SACC的樣本中，發(fā)現(xiàn)腫瘤病理標(biāo)本均表達(dá)HIF-1α，但HIF-1α的表達(dá)水平與腫瘤的范圍、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)。Wang等[13]報(bào)道HIF-1α可激活內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)途徑，促進(jìn)腫瘤新生血管的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致SACC的增殖與生長(zhǎng)。本組64.3%的病例表達(dá)HIF-1α，且HIF-1α的表達(dá)水平與臨床分期密切相關(guān)，提示SACC中HIF-1α的表達(dá)具有一定的普遍性，同時(shí)，由于臨床分期與腫瘤患者的預(yù)后緊密相關(guān)[14]，HIF-1α的表達(dá)水平可能會(huì)影響患者的預(yù)后，這也與Chen等[15]的報(bào)道結(jié)果一致。值得注意的是，本組來(lái)源于小腺體的SACC具有更高的HIF-1α表達(dá)水平。Ko等[16-17]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生于小腺體的SACC患者往往預(yù)后較差且復(fù)發(fā)率較高，本組結(jié)果則部分解釋該現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制。目前關(guān)于小唾液腺來(lái)源的腫瘤組織中HIF-1α 表達(dá)變化的分子機(jī)制，需要進(jìn)一步分析。

BCL-2是著名的抗凋亡蛋白，在腫瘤放射生物學(xué)領(lǐng)域中，BCL-2蛋白高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤對(duì)放療產(chǎn)生抵抗作用[18]，并且在缺氧狀態(tài)下HIF-1α可調(diào)節(jié)BCL-2的表達(dá)[19]。Al-Rawi等[20]報(bào)道在幾乎所有的涎腺惡性腫瘤中均存在BCL-2高表達(dá)，其中以SACC中BCL-2表達(dá)水平最高。本組98.2%的病例中存在BCL-2表達(dá)，其中BCL-2強(qiáng)表達(dá)的樣本為78.6%，其表達(dá)水平與HIF-1α呈正相關(guān)，該相關(guān)性在其他實(shí)體腫瘤組織中也曾有過(guò)報(bào)道，如腎細(xì)胞瘤、嗅神經(jīng)母細(xì)胞瘤等[6,21]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)HIF-1α表達(dá)水平可降低BCL-2蛋白水平， HIF-1α表達(dá)升高則促進(jìn)BCL-2蛋白的累積[22]。本組進(jìn)一步分析顯示，HIF-1α對(duì)SACC臨床分期的影響依賴于BCL-2的表達(dá)水平，僅在強(qiáng)表達(dá)BCL-2的腫瘤中，HIF-1α的表達(dá)對(duì)臨床分期產(chǎn)生影響；反之HIF-1α的表達(dá)水平與臨床分期則不具有相關(guān)性，提示通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)的BCL-2高表達(dá)，可能導(dǎo)致SACC的預(yù)后較差，也部分解釋該腫瘤具有放療抵抗性且復(fù)發(fā)率較高的原因[23]。

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ExpressionofHIF-1αandBCL-2insalivaryadenoidcysticcarcinomaanditsclinicalsignificance

BAO He-gang1, XIAO Liang1, MENG Gang2, WANG Yue-jun3, WANG Feng1, JIN Wen-sen1

(1Teaching&ResearchSectionofNuclearMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China;3DepartmentofPathology,theFourthAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

PurposeTo investigate the relationship of HIF-1α, BCL-2 and clinicopathological features in salivary adenoid cystic carcinoma by detecting the levels of two proteins.MethodsImmunohistochemical of SP staining assay was used

to detect the level of HIF-1α and BCL-2 expression in fifty-six section from primary resection of salivary adenoid cystic carcinoma. Furthermore, the correlation between the expressions of two proteins with clinical data was evaluated through differently statistical analysis.ResultsThirty-six samples (64.3%) were found to express HIF-1α. The level of HIF-1α was significantly correlated with TNM stage of tumors and the primary site of salivary adenoid cystic carcinoma (P<0.05). Positive BCL-2 expression was detected in fifty-five cases (98.2%). The level of HIF-1α was positively correlated with that of BCL-2 (P<0.05) and the significant correlation between HIF-1α and TNM stage was dependent upon the strong expression of BCL-2 (P<0.05).ConclusionIt is therefore indicated that the expression of HIF-1α and BCL-2 may influence the clinical stage of salivary adenoid cystic carcinoma.

salivary neoplasm； adenoid cystic carcinoma； HIF-1α； BCL-2； immunohistochemistry

時(shí)間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.005.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(U1432124)

1安徽醫(yī)科大學(xué)核醫(yī)學(xué)教研室，合肥 2300322安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，合肥 2300223安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院病理科，合肥 230001

鮑合剛，男，碩士研究生。E-mail: 281611117@qq.com 金問(wèn)森，男，碩士生導(dǎo)師，教授，通訊作者。E-mail: wensenjn@126.com

R 739.8

:A

:1001-7399(2017)07-0728-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.005

接受日期：2017-05-23