王永玲，高建芝，閆姝潔，王 瓊，韋立新

HOTAIR-siRNA通過miR-21對肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的影響

王永玲1，高建芝2,3，閆姝潔2，王 瓊3，韋立新3

目的探討長鏈非編碼HOTAIR靶控miR-21對肝癌細(xì)胞侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)檢測30例肝癌組織中miR-21的表達(dá)，及其與臨床病理特征的相關(guān)性；HOTAIR的siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，采用Transwell小室法檢測HepG2細(xì)胞的侵襲活性；應(yīng)用qRT-PCR法檢測HepG2細(xì)胞中miR-21的表達(dá)；采用Western blot法檢測MMP-2蛋白的表達(dá)，并分析其與miR-21的相關(guān)性。結(jié)果qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-21在肝癌組織中的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織(P<0.05)；miR-21表達(dá)與腫瘤惡性程度、分化程度及侵襲轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)；與患者AFP、腫瘤大小及腫瘤數(shù)目無關(guān)。沉默HOTAIR基因后，HepG2細(xì)胞侵襲能力下降，miR-21基因和MMP-2蛋白的表達(dá)均下調(diào)且兩者呈正相關(guān)。結(jié)論miR-21在肝癌組織中呈高表達(dá)，并與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)；HOTAIR可能通過靶控miR-21的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

肝腫瘤；長鏈非編碼RNA；miR-21；侵襲和轉(zhuǎn)移；MMP-2

原發(fā)性肝癌是病死率極高的惡性腫瘤之一，除早期手術(shù)切除外，采用放、化療均不能取得較好療效。目前，諸多學(xué)者從生物學(xué)角度尋找治療肝癌的靶點(diǎn)。研究表明，HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)在結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中的表達(dá)水平與其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后呈正相關(guān)[1-4]。文獻(xiàn)報(bào)道，lncRNA和miRNA之間的關(guān)系密切，miRNA可通過作用于lncRNA影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；lncRNA也可作為miRNA的前體，加工成miRNA后發(fā)揮作用。其中短鏈非編碼RNA-21(miR-21)位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域，是具有自主轉(zhuǎn)錄功能的miRNA，在胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等腫瘤中呈過表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-8]。目前，關(guān)于miR-21對肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)信號蛋白的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制是否與長鏈非編碼HOTAIR的調(diào)控尚不清楚。本文應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)檢測miR-21在肝癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，并將HepG2細(xì)胞的HOTAIR基因沉默，觀察肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化、miR-21基因和MMP-2蛋白的表達(dá)及兩者的相關(guān)性，探討HOTAIR靶控miR-21的表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)信號蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織樣本 收集2012年9月～2013年5月解放軍301醫(yī)院手術(shù)切除的30例肝癌標(biāo)本及對應(yīng)癌旁組織，所有患者術(shù)前均未行放、化療，肝癌組織經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞癌；癌旁組織來源于距離腫瘤邊緣3 cm以上的未侵襲組織。所取組織標(biāo)本立即于液氮中保存，提取RNA備用。所有組織標(biāo)本均已獲得患者同意，并簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞系 HepG2人肝癌細(xì)胞系由中國人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3主要試劑及材料 胎牛血清購自浙江天杭公司；Transwell小室購自加拿大Costar公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Introgen公司；Trizol購自上海世儀公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因的引物序列，全部引物序列由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。兔抗鼠PTEN、MMP-2抗體及GADPH抗體均購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測肝癌組織miR-21的表達(dá)及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-21的表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書提取肝癌組織或細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定其純度及濃度，取比值為1.8～2.0之間的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)TaKaRa試劑盒說明書將miR-21逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，反應(yīng)溫度：42 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，置于4 ℃?zhèn)溆?。?yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-21在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(高表達(dá)：肝癌組織表達(dá)水平較癌旁組織高；低表達(dá)：肝癌組織表達(dá)水平較癌旁組織低)、干擾HOTAIR的HepG2中miR-21的表達(dá)。hsa-miR-21-5p的引物序列為5′-GGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTG-3′；miRNU6-2(內(nèi)參U6)的引物序列為：5′-CTGCGCAAGGATGACACGC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，合計(jì)45個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA干擾試驗(yàn) HepG2肝癌細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清和雙抗的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將HepG2細(xì)胞接種于12孔板中，按Lipofectamine 2000的說明書進(jìn)行操作，將Lipofectamine 2000與HOTAIR的siRNA混勻，室溫放置20 min加入培養(yǎng)HepG2的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，qRT-PCR技術(shù)檢測siRNA的干擾效率。control siRNA作為對照組。

1.2.3Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力 將融化后Matrigel基質(zhì)膠用DMEM培養(yǎng)基稀釋后加100 L于Transwell小室的上室，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h使Matrigel膠凝固，將干預(yù)48 h后的細(xì)胞胰酶消化，用含10 mL/L FBS DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并配成每毫升105個(gè)細(xì)胞懸液，把該細(xì)胞懸液加入200 L于上室，下室加入200 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基600 L，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面未穿過的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，1 g/L結(jié)晶紫染色，PBS沖洗后進(jìn)行高倍顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)(每小室隨機(jī)取5個(gè)視野)，以計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目來間接反映腫瘤細(xì)胞侵襲能力。

1.2.4Western blot檢測細(xì)胞MMP-2的表達(dá) 移去培養(yǎng)液，用1 mL預(yù)冷的1×PBS沖洗細(xì)胞，移去PBS，加入裂解液4 ℃過夜；采用BCA蛋白檢測試劑盒對各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量。按照每孔30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，分別加入按1 ∶2 000比例稀釋MMP-2，一抗4 ℃孵育過夜；1 ∶20 000二抗(山羊抗小鼠IgG HRP)常溫下孵育2 h行顯色、曝光、膠片掃描、定量分析。用Image J圖像分析軟件分析各條帶的灰度值，以目的蛋白對GAPDH相對值記錄結(jié)果，各標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示。采用χ2檢驗(yàn)法評估m(xù)iR-21表達(dá)水平與腫瘤的復(fù)發(fā)及臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-21的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性miR-21的高表達(dá)與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉(zhuǎn)移均相關(guān)(P<0.05)；與患者腫瘤大小、數(shù)目及腫瘤標(biāo)志物AFP等均無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 miR-21與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性

*P<0.05

2.3HOTAIR-siRNA干擾效果檢測及對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOTAIR-siRNA后，HOTAIR mRNA表達(dá)較對照組明顯下調(diào)(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功(圖1)。與對照組相比，HOTAIR-siRNA組侵襲出的細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05，圖2)。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組HOTAIR mRNA的表達(dá)水平

AB

圖2HOTAIR-siRNA對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響：A.對照組；B.HOTAIR-siRNA

2.4HOTAIR-siRNA轉(zhuǎn)染后可下調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOTAIR-siRNA后，miR-21表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05，圖3)。

圖3 實(shí)驗(yàn)各組miR-21的表達(dá)水平

2.5HOTAIR-siRNA轉(zhuǎn)染后MMP-2的表達(dá)及與miR-21的相關(guān)性Western blot結(jié)果表明，HOTAIR-siRNA組MMP-2表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05，圖4)。肝癌細(xì)胞中MMP-2與miR-21的表達(dá)量之間呈正相關(guān)(R2=0.83)。

圖4 實(shí)驗(yàn)各組MMP-2的蛋白表達(dá)

3 討論

非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)是無編碼蛋白質(zhì)，在生物體內(nèi)廣泛存在，是對生命活動(dòng)發(fā)揮重要調(diào)控作用的RNA。根據(jù)ncRNA大小、結(jié)構(gòu)和功能的不同將其分為miRNA、Piwi相互作用RNA(piRNA)和lncRNA等類型[9]。其中l(wèi)ncRNA和miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用是近年學(xué)者研究的熱點(diǎn)。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 bp的非編碼RNA，主要通過遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控[10]。HOTAIR是Rinn小組于2007年發(fā)現(xiàn)的以反式作用調(diào)控基因表達(dá)的lncRNA。大量研究表明，HOTAIR在結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及其預(yù)后密切相關(guān)。本組結(jié)果證實(shí)，肝癌組織中HOTAIR的表達(dá)明顯增高。

miR-21是內(nèi)源性長度約22 nt的非編碼單鏈RNA，被視作原癌基因，其在多數(shù)腫瘤如胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等組織中過表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切[5-8]。本組結(jié)果顯示：miR-21在肝癌組織中呈高表達(dá)，與以往的報(bào)道一致。隨著分析的深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA和miRNA之間存在相互調(diào)節(jié)，lncRNA也可以作為競爭性內(nèi)源性RNA作用于miRNA，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA也可能通過作用于lncRNA，從而實(shí)現(xiàn)對lncRNA的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。本組結(jié)果顯示，miR-21在肝癌組織中的表達(dá)量呈正相關(guān)，并與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-21的高表達(dá)極有可能是引起肝癌的腫瘤增長及生物學(xué)行為惡性改變的主要原因。

為了進(jìn)一步確定HOTAIR在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及與對miR-21的調(diào)控有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)用siRNA沉默肝癌細(xì)胞中HOTAIR基因，應(yīng)用qRT-PCR檢測肝癌組織中miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-21表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除HOTAIR基因后，miR-21低表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞株HepG2的侵襲，進(jìn)一步揭示miR-21具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用。

MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最重要的成員，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)新生血管形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附等作用進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。通過對侵襲因子MMP-2的檢測發(fā)現(xiàn)：沉默HOTAIR基因后，MMP-2蛋白的表達(dá)量明顯下降，并與miR-21的表達(dá)呈正相關(guān)，提示miR-21的下調(diào)可以通過減少M(fèi)MP-2蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-21在肝癌中呈高表達(dá)，并與肝癌惡性程度、腫瘤分化、門靜脈癌栓及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。長鏈非編碼HOTAIR可能通過靶控miR-21的表達(dá)水平進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。因此，HOTAIR可能作為肝癌診斷和判斷預(yù)后的重要標(biāo)志物，也為其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療提供潛在靶點(diǎn)和新的治療思路。

[1] Rinn J L, Kertesz M, Wang J K,etal. Functional demarcation of activeand silent chromatin domains in human HOX loci by nonco-ding RNAs[J]. Cell, 2007,129(7):1311-1323.

[2] Kogo R, Shimamura T, Mimori K,etal. Long noncoding RNA HOTAIR regulates polycomb-dependent chromatin modification and is associated with poor prognosis in colorectal cancers[J]. Cancer Res, 2012,71(20):6320-6326.

[3] Ishibashi M, Kogo R, Shibata K,etal. Clinical significance of the expression of long non-cod ing RNA HOTAIR in primary hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2013,29(3):946-952.

[4] Gupta R A, Shah N, Wang K C,etal. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J]. Nature, 2010,414(7291):1071-1076.

[5] Karimi K Z, Saberi S, Tsai K W,etal. MicroRNA-21: mechanisms of oncogenesis and its application in diagnosis and prognosis of gastric cancer[J]. Arch Iran Med, 2015,18(8):524-536.

[6] Xu Y Z, Xi Q H, Ge W L,etal. Identification of serum microRNA-21 as a biomarker for early detection and prognosis in human epithelial ovarian cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(2):1057-1060.

[7] Zhao Y, Zhao L, Ischenko I,etal. Antisense inhibition of microRNA-21 and microRNA-221 in tumor-initiating stem-like cells modulates tumorigenesis, metastasis, and chemotherapy resistance in pancreatic cancer[J]. Target Oncol, 2015,10(4):535-548.

[8] Xu G, Zhang Y, Wei J,etal. MicroRNA-21 promotes hepatocellular carcinoma HepG2 cell proliferation through repression of mitogen-activated protein kinase-kinase 3[J]. BMC Cancer, 2013,10(13):469.

[9] Harries L W. Long non-coding RNAs and human disease[J]. Biochem Soc Trans, 2012,4(4):902-906.

[10] Taylor D H, Chu E T, Spektor R,etal. Long non-coding RNA regulation of reproduction and development[J]. Mol Reprod Dev, 2015,82(12):932-956.

[11] Jacob A, Prekeris R. The regulation of MMP targeting to invadopodia during cancer metastasis [J]. Front Cell Dev Biol, 2015,3(4):1-8.

EffectofHOTAIR-siRNAoninvasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabymiR-21

WANG Yong-ling1, GAO Jian-zhi2,3, YAN Shu-jie2, WANG Qiong3, WEI Li-xin3

(1BasicMedicalCollegeofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;2DepartmentofOncology,HospitalofZhuozhouCity,Zhuozhou072750,China;3DepartmentofPathology,GeneralHospitalofthePeople’sLiberationArmy,Beijing100080,China)

PurposeTo study the role of lnc-HOTAIR and its target-controlled miR-21 on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells (HCC) and its related mechanisms.MethodsThe expression of miR-21 in 30 cases of HCC was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and correlation with clinical pathology was also analyzed. siRNA of lnc-HOTAIR was transfected to HCC HepG2 cell (HepG2), invasive activities of HepG2 was detected by Transwell, the expression of miR-21 was determined by qRT-PCR, the expression of protein MMP-2 was determined by Western blotting, and the correlation with miR-21 expression was analyzed.ResultsCompared with pericarcinous tissue, the expressions of miR-21 in tumor tissue increased apparently (P<0.05). The expressions of miR-21 correlated positively with malignancy degree, differentiation degree and invasion and metastasis respectively, and correlated negatively with tumour size, tumour number and level of AFP respectively. After silencing the HOTAIR gene, the invasive activities of HepG2 were suppressed, the expression of miR-21 gene and MMP-2 protein were down regulated, and both of them were positively correlated.ConclusionHigh expressions of miR-21 in liver cancer correlate positively with malignancy degree, differentiation degree, intrahepatic and extrahepatic metastases and portal vein tumor thrombus respectively. HOTAIR may inhibit the invasion and metastasis of HCC by controlling the expression level of miR-21.

hepatocellular neoplasm； lncRNA； miR-21； invasion and metastasis； MMP-2

時(shí)間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.003.html

全國博士后56批二等資助(20140435)、河北省保定知識產(chǎn)權(quán)局資助(15ZF062)

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 4530032中國人民解放軍總醫(yī)院合作醫(yī)院涿州市醫(yī)院腫瘤科，涿州 0727503中國人民解放軍總醫(yī)院病理科，北京 100080

王永玲，女，碩士，副教授。E-mail: 838387815@qq.com 高建芝，女，博士后，副主任醫(yī)師，副教授，通訊作者。 E-mail: gaoteng.bao@163.com

R 735.7

:A

:1001-7399(2017)07-0720-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.003

接受日期：2017-05-24