沈 艷，顧 霞，富 玲，鄒紅云，石雨薇

·論 著·

TNF-α和IL-10基因多態(tài)性及其血漿濃度與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的關(guān)系

沈 艷1，顧 霞2，富 玲3，鄒紅云4，石雨薇5

目的探討TNF-α和IL-10基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)、血漿濃度與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)三者之間的關(guān)系。方法采用SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測(cè)38例DLBCL患者及77例健康對(duì)照者TNF-α和IL-10基因6個(gè)位點(diǎn)SNPs，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定血漿TNF-α和IL-10濃度。結(jié)果DLBCL組血漿IL-10水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，TNF-α水平在兩組間差異無明顯相關(guān)性(P>0.05)。在8個(gè)候選的SNPs位點(diǎn)中，TNF-α-863C/A多態(tài)性分布在DLBCL組和對(duì)照組間差異有顯著性，其中CA/AA基因型攜帶者罹患DLBCL的風(fēng)險(xiǎn)為CC基因型的2.280倍(95%CI=1.091～4.765，P=0.028)，其余7個(gè)SNPs多態(tài)性分布在兩組間差異均無顯著性(P>0.05)。在排除患病狀況對(duì)血漿TNF-α和IL-10水平的影響后，各基因多態(tài)性對(duì)其相應(yīng)血漿濃度均無明顯影響(P>0.05)。結(jié)論TNF-α-863C/A位點(diǎn)多態(tài)性與DLBCL易感性有關(guān)，IL-10可能在DLBCL發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；TNF-α；IL-10；單核苷酸多態(tài)性；酶聯(lián)免疫吸附法

細(xì)胞因子是一類由活化的淋巴細(xì)胞或相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞分泌的小分子蛋白，具有多種生物學(xué)功能，在炎癥及免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。近年研究發(fā)現(xiàn)多種免疫相關(guān)細(xì)胞因子及其基因多態(tài)性與淋巴瘤發(fā)生及預(yù)后有關(guān)。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)最常見亞型，占30%～40%；在組織形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳學(xué)及臨床特征上具有高度的異質(zhì)性[1]，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。本文著重探討細(xì)胞因子TNF-α和IL-10基因多態(tài)性、血漿濃度與DLBCL之間的相關(guān)性及臨床意義，以提高認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1材料收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院2010年1月～2011年12月經(jīng)病理確診的 DLBCL患者38例，參照WHO(2008)淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)診斷，根據(jù)霍奇金淋巴瘤Ann Arbor分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。對(duì)照組為同期健康體檢者77例。所有分析對(duì)象近半年內(nèi)未服用過免疫調(diào)節(jié)劑和激素類藥物。

1.2試劑TNF-α和IL-10試劑盒(上海藍(lán)基公司)，引物、溴化乙啶、溴酚蘭(上海生工公司)，DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTP、Hotstar TaqDNA聚合酶、SNaPshot Multiplex Kit、5X Sequencing Buffer等(美國ABI公司)，PCR Marker(美國NEB公司)，HotStarTaq(德國Qiagen公司)；主要儀器包括PCR儀及自動(dòng)測(cè)序儀(美國ABI 3130XL)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本 收集所有病例并抽取外周靜脈血5 mL，采用EDTA抗凝，分離血漿，含有單個(gè)核細(xì)胞的下層成分用DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，分裝后均于-80 ℃保存。

1.3.2血漿TNF-α和IL-10濃度檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3SNPs檢測(cè) 采用SNaPshot SNP分析法進(jìn)行分析。引物序列TNF-α-308G/A和TNF-238G/A：正向5′-TTCTGAAGCCCCTCCCAGTTCT-3′，反向5′-GTTGGGGACACACAAGCATCAA-3′；TNF-α-857C/T：正向5′-GGGGAGATGTGACCACAGCAA-3′，反向5′-ACTC CCTGGGGCCCTCTACAT-3′；TNF-α-863C/A：正向5′-GGGGAAGCAAAGGAGAAGCTGA-3′，反向5′-GC CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3′；IL-10-819T/C和IL-10-592A/C：正向5′-TGGTGTACCCTTGTACAGGTGA TG-3′，反向5′-TTTTACTTTCCAGAGACTGGCTTCC-3′；IL-10-1082A/G：正向5′-CCGGTCCTTCCCCAGG TAGA-3′，反向5′-CCATGGAGGCTGGATAGGAGGT-3′；IL-10-3575T/A：正向5′-ATTTTGGAGCAGGGAT GGAAGA-3′，反向5′-GTGAGAAGGCAGGCACCTAT GG-3′。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 20 s，65～0.5 ℃循環(huán)40 s，72 ℃ 90 s，11個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，24個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸120 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后參照“ABI PRISM SNaPshot Multipelx”試劑盒說明進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物經(jīng)純化后經(jīng)ABI 3130XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.0(美國Applied Bio systems)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。Hardy-Weinberg平衡采用χ2或Fisher精確四表格檢驗(yàn)；組間TNF-α和IL-10濃度比較采用方差分析和t檢驗(yàn)；SNPs與DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估采用非條件邏輯回歸分析，分別對(duì)患者年齡和種族進(jìn)行校正；基因型和患病狀況(有無患病)對(duì)細(xì)胞因子濃度的影響用一般線性模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床特點(diǎn)DLBCL組漢族(23例)、維族(5例)、哈族(3例)，年齡32～81歲，平均55.2歲，其中男性19例，女性12例；臨床分期：Ⅰ期為2例，Ⅱ期為6例，Ⅲ期為10例，Ⅳ為20例。對(duì)照組漢族(54例)、維族(21例)、哈族(2例)，年齡20～77歲，平均43.8歲，其中男性42例，女性35例。

2.2細(xì)胞因子濃度的組間比較DLBCL組血漿IL-10水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而DLBCL組和對(duì)照組間血漿TNF-α濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 DLBCL組和健康對(duì)照組血漿TNF-α和IL-10濃度比較

2.3SNPs與DLBCL的易患性經(jīng)SNaPshot SNP分析數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示各基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型在本組人群中的分布經(jīng)檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律(P>0.05)，確認(rèn)分析樣本均達(dá)到遺傳平衡的群體，具有群體代表性。在8個(gè)候選的SNPs中，TNF-α-863C/A多態(tài)性分布在DLBCL組和對(duì)照組間差異有顯著性，其中CA/AA基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的2.280倍(95%CI=1.091～4.765，P=0.028)，其余7個(gè)SNPs多態(tài)性分布在兩組間差異均無顯著性(P>0.05，表2，圖1、2)。

圖1 SNaPshot電泳峰型圖

橙色峰為SIZE STANDARD，藍(lán)色、綠色、紅色、黑色峰分別代表延伸加入ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸產(chǎn)物，峰下面標(biāo)注的為等位基因；若延伸引物是正向的，等位基因則跟延伸加入的堿基一致；若延伸引物是反向的，則跟延伸加入的堿基互補(bǔ)

圖2 單位點(diǎn)分型圖

A.單一紅色主峰，代表TT基因型，B.綠色和紅色主峰各一個(gè)，代表A/T基因型，C.單一綠色主峰，代表AA基因型

2.4基因型和患病狀況對(duì)細(xì)胞因子濃度的影響患病狀況對(duì)IL-10水平影響顯著，而對(duì)TNF-α水平影響較小；在排除患病狀況對(duì)血漿TNF-α和IL-10水平的影響后，各基因多態(tài)性對(duì)其相應(yīng)血漿濃度影響較小(P>0.05，表3)。

3 討論

TNF-α和IL-10是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，在淋巴細(xì)胞生長、分化和成熟中發(fā)揮重要作用[2-3]，其合成受遺傳因素(基因多態(tài)性)影響。近年TNF-α和IL-10與NHL的關(guān)系引起國內(nèi)外學(xué)者們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，包括基因多態(tài)性與NHL或一些亞型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后的相關(guān)性以及血漿細(xì)胞因子水平與NHL發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系等。實(shí)驗(yàn)由于受檢測(cè)方法、地域和種族等因素的影響，分析結(jié)果尚缺乏一致性。

IL-10由正常B淋巴細(xì)胞、腫瘤性B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌[4]，能夠抑制IL-2和INF-γ的分泌及Th1細(xì)胞的活性，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫殺傷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和播散。本組發(fā)現(xiàn)DLBCL組血漿IL-10水平明顯增高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[5-6]，進(jìn)一步證實(shí)IL-10與DLBCL發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)。此外，已有報(bào)道證實(shí)IL-10高表達(dá)與DLBCL化療耐藥及不良預(yù)后有關(guān)[7-8]，對(duì)臨床具有重要指導(dǎo)意義。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞分泌，是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫功能的關(guān)鍵因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有促進(jìn)和抑制雙重作用[9]。本組DLBCL中TNF-α雖有增高趨勢(shì)，但與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國內(nèi)一些文獻(xiàn)報(bào)道不符，如楊巍巍等[10-11]研究數(shù)據(jù)顯示DLBCL患者血漿TNF-α水平較正常人群顯著升高。國外有關(guān)血漿TNF-α水平與NHL關(guān)系方面的報(bào)道較多，但結(jié)論亦存在明顯不同。如Purdue等[6,12]的2項(xiàng)研究均顯示NHL患者血漿TNF-α水平顯著增高，且TNF-α高表達(dá)人群易患性風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，兩者間呈正相關(guān)關(guān)系；Conroy等[13]報(bào)道TNF-α水平在DLBCL患者無明顯增高，兩者之間無相關(guān)性；Saberi等[14]報(bào)道則證實(shí)B細(xì)胞NHL患者血漿TNF-α水平顯著低于正常人群，且TNF-α高水平組罹患淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，即兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Gu等[15]通過對(duì)大樣本量人群進(jìn)行血漿細(xì)胞因子水平檢測(cè)及其后NHL發(fā)病情況的隨訪發(fā)現(xiàn)，高水平TNF-α與NHL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，但該相關(guān)性因隨訪時(shí)間變長會(huì)被削弱，對(duì)于抽血取樣后隨訪周期大于5年罹患NHL的病例，兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們認(rèn)為血漿TNF-α水平與NHL(包括DLBCL)相關(guān)性受分析者樣本量大小及發(fā)病時(shí)間長短等因素影響較大，兩者之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。雖然DLBCL患者血漿中TNF-α水平未見明顯增高，但我們前期研究顯示它在DLBCL組織中呈高表達(dá)[16]，推測(cè)TNF-α主要通過自分泌和旁分泌在腫瘤局部發(fā)揮作用，包括以自分泌方式作用于腫瘤細(xì)胞自身和以旁分泌方式影響腫瘤微環(huán)境等。

表2 TNF-α和IL-10基因多態(tài)性與DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

表3 TNF-α和IL-10基因SNPs對(duì)相應(yīng)血漿細(xì)胞因子濃度的影響

基因變異如SNPs能夠影響NHL患病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后[17-18]，且對(duì)具有惡性血液系統(tǒng)腫瘤家族史成員影響尤為顯著，可使其罹患NHL的風(fēng)險(xiǎn)增高2～3倍[19]，提示遺傳因素在NHL發(fā)病中起重要作用。近年，已有文獻(xiàn)報(bào)道TNF-α和IL-10基因變異與NHL(包括DLBCL)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，可能的機(jī)制是這些變異影響基因的表達(dá)，進(jìn)而影響人類對(duì)疾病的易感性。但也有部分報(bào)道顯示它們對(duì)NHL發(fā)病無明顯影響，可能該影響作用因不同人種而不同[20]。本實(shí)驗(yàn)顯示TNF-α和IL-10的8個(gè)SNPs中，僅TNF-α-863C/A與DLBCL發(fā)病有關(guān)，其中CA/AA基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的2.280倍，而其他SNPs包括研究較多的幾個(gè)位點(diǎn)如TNF-α-308G/A、IL-10-1082A/G和IL-10-3575T/A與DLBCL發(fā)病均無明顯相關(guān)性。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各SNPs對(duì)其相應(yīng)細(xì)胞因子血漿濃度均無明顯影響，推測(cè)DLBCL患者IL-10水平增高為復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相互作用及調(diào)控結(jié)果。

綜上所述，TNF-α-863C/A多態(tài)性與DLBCL易患性有關(guān)；血漿TNF-α水平在患者中無明顯增高，提示其可能主要在局部發(fā)揮作用，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。IL-10在DLBCL患者血漿中顯著增高，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，可輔助用于病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷。由于本組樣本量偏小，需加大樣本量或聯(lián)合多中心分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步論證。

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CorrelationbetweenpolymorphismsinTNF-αandIL-10genesandplasmacincentrationwithdiffuselargeB-celllymphoma

SHEN Yan1, GU Xia2, FU Ling3, ZOU Hong-yun4, SHI Yu-wei5

(1DepartmentofPathology,theFourthAffiliatedHospitalofGugangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511447,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGugangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China;3DepartmentofHematology,thePeople’sHospitaloftheXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830001,China;4ResearchLaboraryofMedicalScience,theGeneralHospitalofUrumqiMilitaryCommand,Urumqi830000,China;5DepartmentofHematology,theSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830063,China)

PurposeTo explore the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of TNF-αand IL-10 genes as well as their plasma levels and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL).MethodsSnapshot SNP genotype technique was used to assess genetic variation in 6 SNPs for TNF-α and IL-10 in 38 DLBCL cases and 77 healthy controls, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure the plasma concentrations of TNF-α and IL-10 in the above population.ResultsPlasma IL-10 level in DLBCL cases was higher than that in controls (P<0.05), but there was no significant difference in plasma TNF-αlevel between the two groups (P>0.05). Of all the candidate SNPs, the geneotype distribution for TNF-α-863C/A showed significant differences between the case and control groups (P<0.05), and carriers with CA/AA genotypes had more two-fold risks of DLBCL than those with the CC genotype (95%CI=1.091-4.765,P=0.028). However several other candidate SNPs showed no significant difference in the geneotype distributions between the cases and controls (P>0.05). After excluding the effects of disease status on plasma TNF-alpha and IL-10 levels, the polymorphism of each gene had no significant effect on the corresponding plasma concentration (P>0.05).ConclusionTNF-α-863C/A polymorphism may be associated with the risk of DLBCL, and IL-10 play an important role in occurrence and development of DLBCL.

diffuse large B-cell lymphoma； TNF-α； IL-10； single nucleotide polymorphism； enzyme-linked immunosorbent assay

時(shí)間：2017-7-18 11:51 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1151.002.html

國家自然科學(xué)基金(30860096)

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病理科，廣州 5114472廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 5101203新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院血液科，烏魯木齊 8300014蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊 8300005新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，烏魯木齊 830063

沈 艷，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: alice1977@163.com 顧 霞，女，博士，教授，通訊作者。E-mail: guxia1373@sohu.com

R 733.4

:A

:1001-7399(2017)07-0715-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.002

接受日期：2017-05-03