王永倫，封忠昕，葛曉軍

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563003）

BAFF受體在人B淋巴瘤細(xì)胞中的作用研究*

王永倫，封忠昕，葛曉軍

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563003）

目的測(cè)定B細(xì)胞活化因子（BAFF）受體在人B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討B(tài)細(xì)胞活化因子受體（BAFF-R）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在人淋巴瘤細(xì)胞中的作用。方法選取3種人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Daudi、BALL-1，通過流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）及Western blot檢測(cè)BAFF的表達(dá)。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在3種人B淋巴瘤細(xì)胞系中均檢出BAFF-R陽性表達(dá)，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，在3種人B淋巴瘤細(xì)胞系中，BAFF-R基因與蛋白表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Daudi、BALL-1呈陽性表達(dá)，BAFF-R與B淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖關(guān)系密切。

B細(xì)胞活化因子；B細(xì)胞活化因子受體；B淋巴瘤細(xì)胞

B細(xì)胞活化因子（B cell-activating factor，BAFF）是腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）家族成員之一，在B淋巴細(xì)胞的分化和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有3個(gè)受體分別為B細(xì)胞成熟抗原、跨膜激活劑及鈣調(diào)素親環(huán)素配體相互作用分子，以及BAFF細(xì)胞活化因子受體（B cell-activating factor recipient，BAFF-R）。研究表明，BAFF受體的特異性較高，不僅只在B細(xì)胞中表達(dá)，而且只專一地結(jié)合BAFF，而不與TNF家族中的其他成員結(jié)合，是BAFF調(diào)控B細(xì)胞分化的主要介導(dǎo)受體[1-2]。雖然BAFF與血液疾病的關(guān)系已進(jìn)行大量研究，但是BAFF-R是否在B淋巴瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，尚未見報(bào)道。本研究擬選擇3種人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Daudi、BALL-1，檢測(cè)細(xì)胞中BAFF的表達(dá)，為探討B(tài)AFF-R在B淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中起到的調(diào)控機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Daudi與BALL-1購(gòu)自美國(guó)ATCC，由本室保存。無血清細(xì)胞冷凍保存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），RNA抽提試劑盒（日本TaKaRa公司）；細(xì)胞裂解液Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 試劑盒、SsoAdvanced SYBRgreen Supermix熒光定量試劑盒、qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，F(xiàn)ITC anti-human CD268（BAFF-R）Antibody（美國(guó)Bio Legend公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Bioscience公司），細(xì)胞蛋白提取試劑選擇無線電免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液（中性）（北京中山金橋生物科技有限公司），蛋白定量?jī)x（美國(guó)Thermo公司），抗BAFF-R抗體（美國(guó)CST公司），抗β-actin抗體、山羊抗小鼠IgG HRP二抗及山羊抗兔IgG HRP抗體購(gòu)自北京中山金橋生物科技有限公司，蛋白電泳儀與轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），放射自顯影儀（虎丘影像科技蘇州有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存細(xì)胞，37℃迅速融化。1 500 r/min離心3 min，棄上清液，用培養(yǎng)液清洗1遍，離心后棄上清，重懸于含10%熱滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃、5%二氧化碳CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 分別選取5×105個(gè)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期淋巴瘤細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞3次后，PBS重懸細(xì)胞，按照說明書要求加入 FITC anti-human CD268（BAFF-R）流式抗體，避光孵育15 min后，PBS洗滌細(xì)胞3次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)BAFF-R的表達(dá)。陰性對(duì)照細(xì)胞使用未染色的淋巴瘤細(xì)胞。

1.2.3 總RNA的提取和qRT-PCR 提取收集實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞的RNA。反應(yīng)體系：5×Prime ScriptTMBuffer（for real-time）6.0μl，Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ1.5μl，Random 6 mers（100μmol/L）1.5μl，Oligo Dt Prime（r50μmol/L）1.5μl，總RNA 19.5μl，總反應(yīng)體積為30μl。

37℃、15 min逆轉(zhuǎn)錄，85℃、5 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放置于-20℃冰箱冷凍保存。按說明書進(jìn)行qRT-PCR，取1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20μl，內(nèi)含SYBRPremix Ex TaqTM10μl，引物混合液正反向引物各1μl，1‰ DEPC水8μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。人BAFF-R和內(nèi)參β-actin qRT-PCR引物如下：人BAFF-R正向引物（22 bp）：5'-AATCTCTGATGCCAC AGCTCCT-3'，反向引物（19 bp）：5'-TATTGTTGCTCAgGGCCGG-3'；人β-actin正向引物（20 bp）：5'-CCA CGAAACTACCTTCAACTCC-3'，反向引物（20 bp）：5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3'。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△Ct相對(duì)值來反映基因表達(dá)的改變。

1.2.4 細(xì)胞總蛋白的制備和Western blot檢測(cè) 收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并以0.1mol/L pH 7.4的冷PBS離心洗滌，并重懸3次。加入300μl RIPA蛋白裂解液（中性），冰上放置30 min或冰上超聲破碎10 s，4℃、13 000 r/min離心30 min，小心吸取上清液。用Mini Drop 2000分光光度計(jì)測(cè)定提取蛋白濃度，置入-70℃冰箱冷藏備用。

Western blot檢測(cè)：配制分離膠和積層膠，濃縮膠8%，分離膠分別為10%和15%。蛋白樣品與Loading buffer按1∶4混和后于沸水中煮沸3～8 min。取10～20μl蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V，分離膠120 V。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，恒壓100V。5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h或4℃過夜。5%脫脂奶粉稀釋一抗（1∶500～1∶1 500，按抗體說明書要求稀釋），37℃搖床孵育2 h或4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗3次，10～15 min/次。稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶10 000），37℃搖床孵育1 h，TBST洗3次，10～15 min/次。加入顯影液，放射自顯影檢測(cè)目的條帶。β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAFF-RmRNA在3種人B淋巴瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

Raji、Daudi及BALL-13種人B淋巴瘤細(xì)胞系BAFF-R mRNA水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.176、2.150和1.601，均P=0.000）,在Raji、Daudi及BALL-1細(xì)胞系中，BAFF-RmRNA水平較對(duì)照組細(xì)胞（293T細(xì)胞系）呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，各細(xì)胞系中BAFF-R mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組細(xì)胞提高約4倍。在3種人淋巴瘤細(xì)胞系中，Raji與Daudi的BAFF-R mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.829，P=0.002），而Raji與BALL-1、Daudi與BALL-1的BAFF-R mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.362和1.343，P=0.120和0.330）。見圖1。

2.2 BAFF-R蛋白在3種人B淋巴瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

與對(duì)照組細(xì)胞比較，BAFF-R蛋白表達(dá)水平在3種人B淋巴瘤細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。該結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，進(jìn)一步從蛋白水平確定，BAFF-R在Raji、Daudi與BALL-1細(xì)胞系中存在高表達(dá)現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)使用Image J圖像處理軟件對(duì)Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，求出各條帶的灰度值。BAFF-R相對(duì)表達(dá)量比值=BAFF-R灰度值/β-actin灰度值，計(jì)算得到各組細(xì)胞中BAFF-R表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白量的比值，并對(duì)各組蛋白總量比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Raji、Daudi及BALL-1 3種人B淋巴瘤細(xì)胞系BAFF-R蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.262、3.208和2.936，均P=0.000），3種人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系中BAFF-R蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組。3組人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系間比較，Raji與Daudi細(xì)胞系BAFF-R蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.542，P=0.526），Raji與BALL-1、Daudi與BALL-1細(xì)胞系BAFF-R蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.326和1.093，均P=0.000）。見圖2。

圖1 Raji、Daudi、BALL-1細(xì)胞系及對(duì)照組BAFF-R轉(zhuǎn)錄水平

2.3 BAFF-R在3種人B淋巴瘤細(xì)胞系中的陽性表達(dá)

為確定BAFF-R在Raji、Daudi及BALL-1細(xì)胞系中的表達(dá)率，本實(shí)驗(yàn)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3種細(xì)胞系BAFF-R的表達(dá)情況，以陰性峰為參照，區(qū)分出BAFF-R陽性細(xì)胞。3種細(xì)胞系細(xì)胞表面BAFF-R均呈現(xiàn)陽性表達(dá)，表達(dá)率分別為62.11%、87.84%和99.75%（G1=M1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Raji、Daudi及BALL-1細(xì)胞系中，BAFF-R均呈陽性表達(dá)。見圖3。

圖2 3種人B淋巴瘤細(xì)胞系和對(duì)照組BAFF-R蛋白的表達(dá)

圖3 人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系R aj i、D audi及BALL-1細(xì)胞中BAFF-R表達(dá)陽性

3 討論

BAFF又稱BLys、THANK、TALL-l、TNFsF13B及zTNF4，是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF家族的B細(xì)胞激活因子，作用于外周B淋巴細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞池的大小和功能，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化、增殖、抗原呈遞及Ig轉(zhuǎn)換和基因重組，增強(qiáng)B細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的功能的功能，從而使機(jī)體的免疫應(yīng)答增強(qiáng)[3-4]。BAFF胞外段存在長(zhǎng)約150個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，以β片層形式形成三聚體，與受體結(jié)合，通過結(jié)合BAFF-R發(fā)揮其生物學(xué)作用[5-6]。

BAFF-R作為BAFF受體之一，表達(dá)于過度T2型B淋巴細(xì)胞及邊緣區(qū)、濾泡成熟B2細(xì)胞群上的Ⅰ型跨膜蛋白受體，屬于TNF受體超家族成員[7]。B淋巴瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移受BAFF信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，而BAFF-R作為BAFF信號(hào)通路的上游關(guān)鍵信號(hào)分子，在B淋巴瘤細(xì)胞的增殖中起重要的作用[8-9]。研究顯示，BAFF-R不僅表達(dá)于成熟的B淋巴細(xì)胞，而且見于B淋巴瘤細(xì)胞表面，在刺激B淋巴瘤細(xì)胞增殖、避免B淋巴細(xì)胞凋亡等方面，發(fā)揮極其重要的作用[10-11]。

有實(shí)驗(yàn)表明，特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）患兒血清中BAFF的表達(dá)和外周血單個(gè)核細(xì)胞中BAFF mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組，BAFF可能參與ITP發(fā)病機(jī)制[12]。B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤患者BAFF的基因和蛋白表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，且與組織亞型有關(guān)，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、小B細(xì)胞惡性淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤中表達(dá)較高，推測(cè)BAFF與B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。在兒童初發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病血漿中，BAFF及其受體的基因和蛋白表達(dá)水平比健康對(duì)照組增高，緩解期患兒比初發(fā)組下降，推測(cè)BAFF及其受體與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[14]。陳娟等[15]研究發(fā)現(xiàn)，BAFF-R基因和蛋白表達(dá)于MM細(xì)胞中，BAFF-R干預(yù)多發(fā)性骨髓瘤KM3細(xì)胞株后，可促進(jìn)KM3細(xì)胞增殖，抑制凋亡，推測(cè)BAFF-R對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮一定作用。帥小博等[16]研究結(jié)果證實(shí)以上觀點(diǎn)，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BAFF-R定位在KM3細(xì)胞的細(xì)胞膜上；重組人BAFF能夠促進(jìn)BAFF-R基因和蛋白的表達(dá)，認(rèn)為重組人BAFF對(duì)BAFF-R表達(dá)有重要的影響。

本研究選取3種人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Daudi及BALL-1，通過qRT-PCR、Western blot檢測(cè)及流式細(xì)胞術(shù)，從基因到蛋白水平，著重探討B(tài)AFF-R在人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Daudi及BALL-1中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Raji、Daudi及BALL-1細(xì)胞系中BAFF-R均呈高表達(dá)，提示BAFF-R與人B淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖關(guān)系密切，為今后進(jìn)一步研究BAFF信號(hào)通路在人B淋巴瘤細(xì)胞中具體機(jī)制做基礎(chǔ)鋪墊。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]LEVIT-ZERDOUN E,BECKER M,POHLMEYER R,et al.Survival of lga-deficient mature B Cells requires BAFF-R function[J]. Journal of Immunol,2016,195(5)：2348-2360.

[2]LIN W,SESHASAYEE D,LEE W P,et al.Dual B cell immunotherapy is superior to individual anti-CD20 depletion or BAFF blockade in murine models of spontaneous or accelerated lupus[J].Arthritis Rheumatology,2015,67(1)：215-224.

[3]ASSI L K,WONG S H,LUDWING A,et al.Tumor necrosis factor alpha activatas release of B lymphocyte stimulator by neutrophils infiltrating the rheumatoid joint[J].Arthritis Rheumatology, 2007,56(6)：1776-1786.

[4]SUN J,LIN Z,FENG J,et al.BAFF-targeting therapy,a promising strategy for treating autoimmune diseases[J].European Journal of Pharmacology,2008,597(1)：1-5.

[5]XIAO Y,MOTOMURA S,PODACK E R.APRIL(TNFSF13) regulates collagen-induced arthritis,IL-17 production and Th2 response[J].European Journal of Immunology,2008,38(12)：3450-3458.

[6]SHAN X,CHEN L,CAO M,et al.Effects of human soluble BAFF synthesized in escherichia coli on CD4 (+)and CD8(+) T lymphocytes as well as NK cells in mice[J].Physiological Research,2006,55(3)：301-307.

[7]ZHANG X,PARK C S,YOON S O,et al.BAFF supports human B cell differentiation in the lymphoid follicles through distinct receptors[J].International Immunology,2005,17(6)：779-788.

[8]LAIg N,SUTHERLAND A P R,NEWTON R,et al.B cell-activating factor belonging to the TNF family (BAFF)-R is the principal BAFF receptor facilitating BAFF costimulation of circu lating T and B cells[J].The Journal of Immunology,2004,173(2)：807-817.

[9]SCHNEIDER P,MACKAY F,STEINER V,et al.BAFF,a novel ligand of the tumor necrosis factor family,stimulates B cellgrowth[J].The Journal of Experimental Medicine,1999,189(11)：1747-1756.

[10]RODIG S J,SHAHSAFAEI A,LI B,et al.BAFF-R,the major B cell-activating factor receptor,is expressed on most mature B cells and B-cell lymphoproliferative disorders[J].Human Pathology,2005,36(10)：1113-1119.

[11]HE B,CHADBURN A,JOU E,et al.Lymphoma B cells evade apoptosis through the TNF family members BAFF/BLyS and APRIL[J].The Journal of Immunology,2004,8704(5)：297-311.

[12]張軍紅,徐酉華.特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒血清B細(xì)胞激活因子變化的意義[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2010,25(3)：195-197.

[13]浦江,褚少朋,王梅,等.B細(xì)胞活化因子及其特異性受體BAFF-R在B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)及其意義[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2015,35(11)：821-826.

[14]吳利輝,孫寶蘭,徐美玉,等.兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中BAFF、APRIL及其受體的表達(dá)研究 [J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2014, 30(7)：950-955.

[15]陳娟,郭悅?cè)A,鞠少卿,等.多發(fā)性骨髓瘤中BAFF-R表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞存活影響的研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(3)：12-15.

[16]帥小博,鞠少卿,申嫻娟,等.重組人BAFF對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞BAFF-R表達(dá)調(diào)控的初步研究[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2015, 35(1)：24-26.

（童穎丹 編輯）

BAFF-R expression in B cell lymphoma*

Yong-lun Wang,Zhong-xin Feng,Xiao-junge
(Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi,Guizhou 563003,China)

ObjectiveTo detemine the expression of B-cell activating factor receptor (BAFF-R)in B cell lymphoma and to explore the role of BAFF-R signal transduction in B cell lymphoma.MethodsHuman B-cell lymphoma cell lines Raji,Daudi and BALL-1 were selected as the objects of study.BAFF-R expression was detected by flow cytometry,qRT-PCR and Western blot.MethodsFlow cytometryMethodsdemonstrated that BAFF-R was up-regulated in all the three cell lines,qRT-PCR and Western-blot indicated the sameMethods.ConclusionsBAFF-R expression is up-regulated in all the three B-cell lymphoma cell lines,and closely correlated to thegrowth and proliferation of B-cell lymphoma.

B-cell activating factor,B-cell activating factor receptor,B-cell lymphoma

R733.7

A

2016-05-19

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81560487）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金 [No：黔科合J（2011）2264]

葛曉軍，E-mail：gxj_199421@163.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.003

1005-8982（2017）20-0011-05