謝傳美，袁國華

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 風(fēng)濕科，四川 南充 637000）

芍藥甘草附子湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠下丘腦室旁核nN OS、IL-1β及TNF-α表達(dá)的影響

謝傳美，袁國華

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 風(fēng)濕科，四川 南充 637000）

目的探討芍藥甘草附子湯（PGAD）對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）大鼠下丘腦室旁核神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）、白介素1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)的影響。方法選取48只健康Wistar大鼠，隨機(jī)分3組，每組16只，分別為對照組、模型組及藥物干預(yù)組。由Ⅱ型膠原酶誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠，采用大鼠關(guān)節(jié)炎評分法和足爪腫脹評分法評價其模型是否復(fù)制成功；30mg/kg PGAD灌胃；免疫熒光和Western blot檢測下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α的表達(dá)。結(jié)果3組大鼠關(guān)節(jié)炎評分、足爪腫脹評分、下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α表達(dá)比較，模型組和藥物干預(yù)組較對照組升高（P＜0.05），藥物干預(yù)組較模型組下降（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)GAD對RA大鼠有治療、保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α表達(dá)有關(guān)。

芍藥甘草附子湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；下丘腦室旁核；一氧化氮合酶；白介素1β；腫瘤壞死因子α

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性對稱性多關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為主要特征的全身性自身免疫性疾病[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，RA患者糖皮質(zhì)激素嚴(yán)重缺乏，已經(jīng)證實糖皮質(zhì)激素嚴(yán)重缺乏是RA的一個重要發(fā)病機(jī)制[2-3]。近年來，RA在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫學(xué)方面的發(fā)病機(jī)制研究越來越受到關(guān)注，下丘腦-垂體 -腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPAA）功能在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用[4]。下丘腦的室旁核（paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN）是調(diào)節(jié)HPAA的主要核團(tuán)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草附子湯（paeoniae andglycyrrhizae and a coniti decoction，PGAD）能有效緩解RA的癥狀，控制病情的快速發(fā)展，臨床療效較好，是一種治療RA的手段[6]。但是PGAD預(yù)防與治療RA的具體機(jī)制尚未報道。本研究通過觀察PGAD是否通過血腦屏障，進(jìn)而影響下丘腦室旁核內(nèi)神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal nitricoxi'desynthase，nNOS）、白介素 1β（Interleukin-1β，IL-1β）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)，探討PGAD是否通過影響PVN區(qū)nNOS、IL-1β及TNF-α的表達(dá)對RA起治療、保護(hù)的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

選取健康雌性Wistar大鼠48只，體重220～260g（川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），動物飼養(yǎng)室溫（20±2）℃，濕度43%～45%，常規(guī)自由攝食、飲水，將動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始進(jìn)行實驗。

1.2 藥品與試劑

PGAD購自廣州廣修堂醫(yī)藥科技有限公司，含量≥30%。完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司，nNOS、IL-1β及TNF-α一抗購自美國Abcam公司，兔抗大鼠抗體購自Abcam公司，山羊抗兔購自Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.3 實驗動物分組

SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及藥物干預(yù)組（PGAD 30 mg/kg），每組16只。

1.4 方法

1.4.1 模型的復(fù)制 藥物干預(yù)組大鼠按照30 mg/kg劑量給藥[7]。模型組和藥物干預(yù)組每只實驗大鼠注射完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型[8-9]。藥物干預(yù)組在模型復(fù)制過程中即可開始給藥，每天灌胃給藥，直至取材。模型組和對照組給予等劑量的生理鹽水灌胃。

1.4.2 關(guān)節(jié)觀察及評分 關(guān)節(jié)炎評分規(guī)定[10]：每只RA模型大鼠的關(guān)節(jié)炎最高評分為8分。以下情況計為1分：①有1只耳朵出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫；②1只鼻子出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫；③1只尾巴出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫；④1只足爪出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫。

足爪腫脹評分規(guī)定[11]：每只RA模型大鼠的足爪腫脹最高評分為24分。以下情況計為1分：①1只腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫；②每個小關(guān)節(jié)出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫（每只足爪包括5只指關(guān)節(jié)或趾關(guān)節(jié)）。

1.4.3 取材 在藥物干預(yù)后第21天進(jìn)行灌注。30%水合氯醛麻醉，500 ml生理鹽水沖洗，40g/L多聚甲醛 +0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）pH值7.2灌注固定。灌注完在冰塊上小心取下丘腦組織，包埋切片，厚14μm。

1.4.4 免疫熒光法染色 采用免疫熒光法染色檢測nNOS，IL-1β及TNF-α陽性神經(jīng)元。將切片從-80℃冰箱取出，復(fù)溫10min，0.01mol PBS沖洗3次；30%Triton打孔1h；5%牛血清37℃封閉孵育1h；加nNOS1、IL-1β及TNF-α一抗（1∶200），4℃過夜，加二抗1∶200，放入37℃恒溫箱溫育1 h，PBS沖洗。滴加熒光封片劑，封片。熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍攝，利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4.5 Western blot檢測 實驗結(jié)束30 min后迅速斷頭處死大鼠，取出腦組織。游離下丘腦室旁核，放置于-80℃冰箱冷凍保存。4℃下將PVN區(qū)切片，裂解分離PVN區(qū)組織，然后經(jīng)勻漿液離心，提取PVN區(qū)總蛋白，離心總蛋白，超聲波裂解，從裂解液中分離提取生物化蛋白。組織勻漿后提取蛋白成分變性，蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠（積層膠濃度6%，分離膠濃度10%）電泳2 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（濕轉(zhuǎn)300 mA，1.5 h或110 V，1 h）。轉(zhuǎn)膜后置于3%牛血清蛋白溶液中孵育；加一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗一抗；加二抗（1∶1 000）室溫孵育40 min，TBST洗二抗，發(fā)光。采用NIH Image J和Imagine軟件進(jìn)行圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 PG AD治療R A大鼠的療效分析

RA模型大鼠第17天出現(xiàn)RA癥狀：四肢、耳朵、鼻子、尾巴出現(xiàn)紅腫或結(jié)節(jié)。對照組、模型組及藥物干預(yù)組關(guān)節(jié)炎評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.341，P=0.000），進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，模型組和藥物干預(yù)組關(guān)節(jié)炎評分高于對照組（q=23.649和18.219，均P=0.000）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠關(guān)節(jié)炎評分降低（q=20.401，P= 0.000）（見圖1A）。第17天各組大鼠足爪腫脹評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=65.612，P= 0.000），進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，模型組和藥物干預(yù)組大鼠足爪腫脹評分高于對照組（q=46.469和21.655，均P=0.000）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠的足爪腫脹評分降低（q=36.129，P=0.000）（見圖1B）。

2.2 PG AD對 R A大鼠下丘腦室旁核 nNOS、IL-1β及TNF-α陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響

對照組、模型組及藥物干預(yù)組的大鼠下丘腦室旁核nNOS陽性神經(jīng)元量分別為34.000、42.000和19.000 pg/ml，IL-1β陽性神經(jīng)元量分別為0.183、0.610和0.376 pg/ml，TNF-α陽性神經(jīng)元量分別為0.890、2.343和1.776 pg/ml（見圖2）。各組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α陽性神經(jīng)元量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=51.712、55.626和71.916，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，模型組和藥物干預(yù)組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α陽性神經(jīng)元數(shù)量高于對照組（P＜0.05）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α陽性神經(jīng)元數(shù)量降低（P＜0.05）（見圖3）。

圖1 PD AG治療R A大鼠的療效分析 （n=16，±s）

圖2 各組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α陽性神經(jīng)元的表達(dá) （免疫熒光法×40）

圖3 各組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α陽性神經(jīng)元表達(dá)比較 （n=16，±s）

2.3 PG AD對R A大鼠下丘腦室旁核蛋白表達(dá)的影響

對照組、模型組及藥物干預(yù)組的大鼠下丘腦室旁核 nNOS的表達(dá)量分別為 19.7%、54.3%和3.41%，IL-1β的表達(dá)量分別為 1.75%、28.9%和2.06%，TNF-α的表達(dá)量分別為12.4%、26.7%和22.6%（見圖4）。各組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α的表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.188、38.912和61.523，均P= 0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，模型組和藥物干預(yù)組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及 TNF-α的表達(dá)量高于對照組（P＜0.05）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α表達(dá)量降低（P＜0.05）（見圖5）。

圖4 各組大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α蛋白的表達(dá)

圖5 各組R A大鼠下丘腦室旁核nNOS、IL-1β及TNF-α蛋白表達(dá)的比較 （n=16，±s）

3 討論

RA屬于“痹證”范疇，中醫(yī)認(rèn)為風(fēng)、寒、濕、熱諸邪是RA發(fā)生、發(fā)展的外部條件，而諸虛內(nèi)存，芷氣不足是其發(fā)病的內(nèi)因?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要以藥物治療為主，如非甾體抗炎藥、改變病情的抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素等，目的在于減輕疼痛、控制病情進(jìn)展。由于服藥時間長，毒副作用大，患者往往難以接受。芍藥甘草附子湯出自《傷寒論》，見于68條。發(fā)汗，病不解，反惡寒者，虛故也，芍藥甘草附子湯主之。由自芍、炙甘草、炮附子3味藥組成。該中藥可以改善RA癥狀，毒副作用較小，易長期堅持服用，但其具體機(jī)制尚不明確。

下丘腦室旁核具有中樞調(diào)控與整合作用，是機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)聯(lián)系的樞紐。研究發(fā)現(xiàn)，nNOS是一種同工酶，存在于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)吞噬細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞中。nNOS存在于神經(jīng)元中，在不同腦區(qū)呈選擇性分布。在PVN中存在較多的神經(jīng)元型nNOS陽性神經(jīng)元，大鼠腦室內(nèi)注人nNOS的抑制劑后，能促進(jìn)室旁核釋放因子的合成及促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，因此nNOS可能對HPAA起抑制調(diào)節(jié)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)制模型后第21天，模型組大鼠RA癥狀較對照組明顯；與對照組比較，模型組PVN區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元水平與蛋白的表達(dá)增多，因此RA大鼠PVN區(qū)nNOS功能處于活躍狀態(tài)。經(jīng)PGAD治療后，與模型組比較，藥物干預(yù)組組足腫脹度低于模型組，具有治療、保護(hù)作用，同時PVN區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元水平與蛋白的表達(dá)降低。因此，本研究推測PGAD對RA具有治療、保護(hù)作用與PVN區(qū)nNOS水平變化有關(guān)。

RA是一種伴有炎癥細(xì)胞浸潤和骨質(zhì)侵蝕的滑膜組織增生性疾病?；そM織的增生、炎癥反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)相互作用、相互聯(lián)系，共同推動病情進(jìn)展[13-14]。在炎癥部位、關(guān)節(jié)積液及滑膜組織中，可檢測到多種細(xì)胞因子。許多細(xì)胞因子被公認(rèn)為是RA炎癥及關(guān)節(jié)損傷的重要分子，該細(xì)胞因子參與RA的整個病理過程[15]。根據(jù)細(xì)胞來源不同，將細(xì)胞因子分為2大類，一類包括IL-2、IL-4、IL-10等主要由T細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子；另一類包括IL-1、IL-6、TNF-α等主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子。PGAD治療RA大鼠后，TNF-α、IL-6及IL-1β水平降低，表明PGAD對RA的作用機(jī)制與抑制TNF-α和IL-1β水平密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA大鼠PVN區(qū)nNOS、TNF-α及IL-1β含量較對照組升高。PGAD灌胃治療后，大鼠PVN區(qū)nNOS、TNF-α及IL-1β含量降低，提示降低PVN區(qū)nNOS、TNF-α及IL-1β水平能影響PGAD治療RA的療效。

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（童穎丹 編輯）

Effect of PGAD on nNOS,IL-1βand TNF-αexpressions in hypothalamic paraventricular nuclei of rats with rheumatoid arthtis

Chuan-mei Xie,Guo-hua Yuan
(Department of Rheumatology,the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong,Sichuan 637000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Peony andglycyrrhiza and Aconite Decoction(PGAD) on the expressions of neuronal nitric oxide synthase (nNOS),IL-1β and TNF-α in the hypothalamic paraventricular nuclei of the rats with rheumatoid arthritis.MethodsForty-eight healthy Wistar rats were randomly divided into controlgroup,modelgroup and PGAD-interventiongroup with 16 in eachgroup.The arthritis rat model was induced by typeⅡ collagenase and evaluated by arthritis score and paw swelling score.The arthritis rats in the PGAD intervention group were given 30 mg/kg PGAD by gavage. Immunofluorescence and Western blot were used to detect the nNOS,IL-1β and TNF-α expressions in the hypothalamic paraventricular nuclei.MethodsThe arthritis score,the paw swelling score,and the expressions of nNOS,IL-1β and TNF-α in the hypothalamic paraventricular nuclei were significantly higher in the model and PGAD-interventiongroups than in the controlgroup (P＜0.05).but significantly lower in the PGAD interventiongroup than in the modelgroup(P＜0.05).ConclusionsPGAD has therapeutic and protective effect on the rats with rheumatoid arthritis,which may be related to the inhibition of nNOS,IL-1β and TNF-α expressions in the hypothalamic paraventricular nuclei.

Peony and Glycyrrhiza and Aconite Decoction;rheumatoid arthritis;hypothalamic paraventricular nucleus;nNOS;IL-1β;TNF-α

R392

A

2016-05-26

袁國華，E-mail：ghuayuan1996@yahoo.com；Tel：13990799112

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.002

1005-8982（2017）20-0006-05