陳榮華 李勤光 趙敏 柳麗娟

高靈敏熒光定量PCR技術(shù)在乙肝患者中的應(yīng)用分析

陳榮華 李勤光 趙敏 柳麗娟

目的研究高靈敏熒光定量PCR技術(shù)在乙肝患者中的應(yīng)用效果。方法現(xiàn)研究選取的研究對象為2016年10月—2017年6月在我院進(jìn)行治療的乙肝患者923例和同期在本院進(jìn)行體檢的健康體檢者200例。使用高靈敏熒光定量PCR技術(shù)檢測兩組受檢者。結(jié)果不同血清標(biāo)志物陽性乙肝患者的HBV-DNA拷貝數(shù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），陽性率分別為35．97%、57．96%、6．07%，乙肝患者間進(jìn)行比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論采用高靈敏熒光定量PCR技術(shù)可較好的診出乙肝，還可監(jiān)測治療過程及評(píng)價(jià)藥效。

乙肝；高靈敏熒光定量PCR技術(shù)；應(yīng)用效果

乙肝指的是乙肝病毒檢測為陽性且病程在半年以上的病癥[1]，以惡心、乏力、腹脹、畏食、肝區(qū)疼痛為主要臨床癥狀[2-3]，病情嚴(yán)重的患者持續(xù)存在肝功能異常、脾大、蜘蛛痣等表現(xiàn)。乙肝患者若未得到及時(shí)、有效的治療，會(huì)向肝纖維化、肝硬化、原發(fā)性肝癌進(jìn)展[4]，故此盡早診治乙肝具有十分重要的意義?，F(xiàn)旨在探討高靈敏熒光定量PCR技術(shù)（熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）應(yīng)用在乙肝患者乙肝病毒檢測中的效果，從我院收治的乙肝患者中抽取923例和同期健康體檢者200例作為對象展開研究，報(bào)道如下：

1 資料和方法

1.1 資料

研究對象：我院2016年10月—2017年6月收治的乙肝患者923例、同期在本院進(jìn)行體檢的健康體檢者200例。乙肝患者均與中國2010版“慢性乙型肝炎防治指南”的慢性HBV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)相符合。

乙肝組：男性患者714例，女209例，年齡12～89歲，平均（37.20±5.94）歲。

健康組：男性患者112例，女性患者88例，年齡12～87歲，平均（37.83±5.76）歲。

兩組受檢者之間對比基線資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

儀器選用羅氏的cobas AmpliPrep 自動(dòng)核酸提取儀和cobas TaqMan 48 PCR擴(kuò)增儀。采集兩組受檢者的清晨空腹靜脈血5 ml，進(jìn)行離心，取離心后的血漿650 μl在cobas AmpliPrep 自動(dòng)核酸提取儀配套的樣本管中，并在儀器上記錄好樣本編號(hào)，在對儀器進(jìn)行常規(guī)的維護(hù)保養(yǎng)之后，檢查儀器狀態(tài)為正常的情況下開始樣本的自動(dòng)提取過程。整個(gè)提取過程大概為1 h。提取結(jié)束后，cobas AmpliPrep 自動(dòng)核酸提取儀已經(jīng)將提取好的核酸上清液與PCR反應(yīng)混合液、耐熱聚合酶（Taq酶）以及內(nèi)標(biāo)等全部混勻并收集在同一個(gè)擴(kuò)增管（K管）中。將放置有K管的托盤小心轉(zhuǎn)運(yùn)至cobas TaqMan 48 PCR擴(kuò)增儀，完成核酸的擴(kuò)增過程。擴(kuò)增儀循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95℃預(yù)變性2 min，94℃、55℃、72℃的保持時(shí)間分別為8 s、40 s、55 s，在經(jīng)過40次循環(huán)后增加40℃恒溫時(shí)間（2 min）。在擴(kuò)增結(jié)束后觀察每管的內(nèi)參是否有擴(kuò)增，確保了實(shí)驗(yàn)的真實(shí)有效后，將擴(kuò)增后的測定值測出后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出標(biāo)本中的DNA拷貝數(shù)，陰性結(jié)果作為對照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組受檢者經(jīng)高靈敏熒光定量PCR技術(shù)檢查血清標(biāo)志物檢出情況，其中1、3、4、5分別代表乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎E抗原、抗-Hbe、抗-Hbc。同時(shí)觀察乙肝患者的HBV-DNA拷貝數(shù)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將本文數(shù)據(jù)錄入到SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料（血清標(biāo)志物檢出情況）采用（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料（HBV-DNA拷貝數(shù)）采用表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

檢查結(jié)果顯示，乙肝組患者的血清標(biāo)志物情況均為陽性，健康組均為陰性；乙肝組中血清標(biāo)志物不同陽性檢出情況的HBVDNA拷貝數(shù)對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=673.62，P=0.01。見表1。

表1 對比兩組受檢者的血清標(biāo)志物情況和HBV-DNA拷貝數(shù)情況

3 討論

乙肝出現(xiàn)的直接原因?yàn)橐倚透窝撞《靖腥荆硗饧易逍詡鞑?、嬰幼兒期感染病毒、缺乏預(yù)防意識(shí)、漏診、既往有其他肝病史感染病毒等也是乙肝的主要發(fā)病原因。乙肝的傳染源為乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒攜帶者，乙肝的潛伏期為6周～6個(gè)月，乙型肝炎病毒的傳播途徑包括血和血液制品傳播、母嬰傳播、性接觸傳播、經(jīng)破損的皮膚黏膜傳播[5-6]，具有較強(qiáng)的傳染性，感染乙型肝炎病毒后，受多種因素的影響，患者會(huì)出現(xiàn)不同的乙肝類型。盡早對診斷乙肝，有利于及時(shí)采取有效的治療措施控制病情進(jìn)展，控制傳染源，促進(jìn)預(yù)后效果的提高。

在臨床診斷乙肝中，通常檢測的指標(biāo)為天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽紅素以及乙肝病毒標(biāo)記物、血清HBV-DNA。近年來生物技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步提高了乙肝病毒快速檢測技術(shù)的水平，以往檢測乙肝病毒的方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和普通定量PCR技術(shù)等，其中ELISA法主要依靠抗原抗體的特異性反應(yīng)檢測乙肝患者血清中的HBV-M，能夠?qū)⒒颊吣壳耙欢螘r(shí)間內(nèi)體內(nèi)病毒的免疫學(xué)反應(yīng)顯示出來，但ELISA法檢測乙肝病毒的精確度有限；普通定量PCR技術(shù)是微量核酸擴(kuò)增的有效工具，在病毒、細(xì)菌病原體及遺傳病、腫瘤的早期診斷中應(yīng)用廣泛，具有較高的靈敏性和特異性，可檢測病毒或腫瘤的治療過程，調(diào)控機(jī)體基因表達(dá)，但其存在不能定量和判斷污染所致的假陽性情況[7]；本次研究中使用的高靈敏熒光定量PCR技術(shù)與普通定量PCR技術(shù)相比存在的不同之處在于其PCR的指數(shù)曲線為S形，不為標(biāo)準(zhǔn)的增高曲線，而且每一個(gè)擴(kuò)增管都為單一的標(biāo)準(zhǔn)對照，在很大的程度上排除了孔間差異（普通定量PCR技術(shù)一般為金屬浴加熱，受加熱不均勻的影響，每管的實(shí)際溫度差異直接導(dǎo)致了擴(kuò)增效率的不一致）對結(jié)果的影響。相對而言高靈敏熒光定量PCR技術(shù)的精確度更高。

高靈敏熒光定量PCR技術(shù)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中以熒光化學(xué)物質(zhì)測量每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。熒光定量PCR技術(shù)的基本原理為依據(jù)熒光能量的轉(zhuǎn)移定量分析DNA分子，對信號(hào)引物DNA分子的2條鏈進(jìn)行標(biāo)記，2條鏈在配對互補(bǔ)時(shí)會(huì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而出現(xiàn)熒光，在雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞變?yōu)閱捂湑r(shí)，熒光會(huì)消失，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化可得出DNA定量檢測結(jié)果。臨床中熒光定量PCR技術(shù)一般使用熒光探針和熒光染料作為熒光化學(xué)物質(zhì)，其方法有特異類和非特異類之分，特異類檢測方法指的是利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針檢測PCR反應(yīng)的產(chǎn)物；非特異類檢測方法指的是在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，熒光染料與DNA雙鏈特異性摻入后發(fā)射出熒光信號(hào)。兩種方法各具優(yōu)勢。

高靈敏熒光定量PCR技術(shù)在多種病原微生物的定量檢測中應(yīng)用廣泛，優(yōu)點(diǎn)包括以下幾點(diǎn)：（1）熒光標(biāo)記的DNA探針特異性與病原微生物DNA全長進(jìn)行雜交，可增強(qiáng)特異性，使假陽性率降低[8]。（2）高靈敏熒光定量PCR技術(shù)檢測產(chǎn)物以PCR產(chǎn)物中的熒光信號(hào)為準(zhǔn)，可進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測，具有較高的靈敏度和很寬的定量范圍，HBV-DNA、定量準(zhǔn)確度可達(dá)到0～1×1011拷貝/m1、100%，臨床診斷的需要能夠被滿足。（3）高靈敏熒光定量PCR技術(shù)在密閉的環(huán)境下進(jìn)行檢測，在實(shí)施PCR后無需實(shí)施處理和冗長的電泳檢測，可使實(shí)施中的交叉污染減少，促進(jìn)檢測精確度的提高。（4）高靈敏熒光定量PCR技術(shù)的檢測下限遠(yuǎn)優(yōu)于普通熒光定量PCR技術(shù)，檢測下限可達(dá)到20 IU/ml，普通熒光定量PCR技術(shù)的檢測下限一般為500 IU/ml，高靈敏熒光定量PCR技術(shù)，檢測下限可達(dá)到20 IU/ml。高靈敏熒光定量PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度高以及結(jié)果得出速度快的優(yōu)點(diǎn)，在檢測乙肝病毒中可通過DNA體外擴(kuò)增技術(shù)定量檢測患者血清中的HBV-DNA病毒載量，對乙肝患者血液內(nèi)病毒的復(fù)制情況進(jìn)行明確，其還能有效反映HBV自身拷貝數(shù)、HBV的感染和恢復(fù)情況，為臨床治療的效果、預(yù)后效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，有利于臨床及時(shí)調(diào)整抗病毒治療方案，促進(jìn)臨床治療效果的提升。

在本次研究中，923例乙肝患者經(jīng)熒光定量PCR技術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎表面抗原、HBeAg、抗-Hbc陽性乙肝患者為332例（35.97%），其HBV-DNA拷貝數(shù)為（3 018.74±60.65×105個(gè)/μl），HBV-DNA水平高；乙型肝炎表面抗原、抗-Hbe、抗-Hbc陽性乙肝患者為535例（57.96%），其HBV-DNA拷貝數(shù)為（60.62±28.53×105個(gè)/μl），HBV-DNA水平低，；HBsAg、抗-Hbc陽性乙肝患者為56例（6.07%），血清中未檢出HBV-DNA。研究數(shù)據(jù)說明高靈敏熒光定量PCR技術(shù)能夠較好的發(fā)現(xiàn)陽性乙肝患者血清中的HBV-DNA，且拷貝數(shù)會(huì)隨著患者血清陽性率的降低而減少。健康體檢者的HBV-DNA水平均為陰性，且不存在拷貝數(shù)，說明高靈敏熒光定量PCR技術(shù)可有效檢測出乙肝病毒。

乙肝患者體內(nèi)HBV-DNA載量和HBeAg含量可作為病毒復(fù)制的有效指標(biāo)，高靈敏熒光定量PCR技術(shù)所得出的檢測結(jié)果能夠?qū)C(jī)體免疫反應(yīng)所致肝臟損傷進(jìn)行判斷，還可早期診斷乙肝、判斷乙肝傳染性，有助于制定抗病毒治療方案和篩選藥物，另外還能評(píng)價(jià)藥物的療效（主要是乙肝病毒數(shù)量的增加來進(jìn)行判斷），以便臨床治療方案的及時(shí)調(diào)整，提高臨床治療效果的同時(shí)提高預(yù)后效果。

總之，在檢測乙肝病毒中，高靈敏熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)勢明顯，不僅能夠?yàn)榕R床治療方法的選擇進(jìn)行指導(dǎo)，其臨床數(shù)據(jù)還能夠幫助醫(yī)生及時(shí)掌握患者的病情變化以及藥物的治療效果，有助于提高患者的生存質(zhì)量。

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The Analysis of Application of High Sensitive Fluorescence Quantitative PCR Technique in Hepatitis B Patients

CHEN Ronghua LI Qin’guang ZHAO Min LIU Lijuan Institute of Liver Diseases, Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou Fujian 350025, China

ObjectiveTo study the effect of high sensitive fluorescence quantitative PCR in patients with hepatitis B.Methods923 cases of hepatitis B patients treated in our hospital from October 2016 to June 2017, and 200 patients who had physical examination in our hospital during the same period were selected into the study. Two groups of patients were detected by high sensitive fluorescence quantitative PCR.ResultsThere were differences in HBV-DNA copy number (P＜ 0.05), and the positive rate was 35.97%, 57.96% and 6.07%, and the difference between hepatitis B patients was signifcant (P＜ 0.05).ConclusionHigh sensitive fuorescence quantitative PCR technique can be used to diagnose hepatitis B, it can also monitor the treatment process and evaluate the effcacy.

hepatitis B; high sensitive fluorescence quantitative PCR technology; application effect

R446

A

1674-9316（2017）18-0104-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．18．054

福州市衛(wèi)計(jì)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016-S-wt9）

福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院肝病研究所，福建 福州 350025通信作者：柳麗娟