朱志娟，王琪影，王曉利，宋鳳敏

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 整形外科，河南 鄭州450052）

5-氨基酮戊酸光動力療法對瘢痕成纖維細(xì)胞的作用研究

朱志娟，王琪影，王曉利，宋鳳敏

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 整形外科，河南 鄭州450052）

目的研究5-氨基酮戊酸光動力療法（ALA-PDT）對瘢痕成纖維細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為臨床運用ALA-PDT治療瘢痕疙瘩提供理論依據(jù)。方法取人瘢痕成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，并將生長狀態(tài)無明顯差異的瘢痕成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、磷酸鹽緩沖液（PBS）組以及6個不同濃度的5-氨基酮戊酸（ALA）培養(yǎng)液組。每組給予635 nm發(fā)光二極管（LED）激光器照射。采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測ALA-PDT對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響，并應(yīng)用實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）和Western blot檢測各組瘢痕成纖維細(xì)胞中膠原蛋白Ⅲ（CollagenⅢ）mRNA水平和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與空白對照組及PBS組比較，CCK-8結(jié)果表明，ALA-PDT能抑制瘢痕成纖維細(xì)胞生長，其抑制作用隨著ALA濃度增加逐漸增強(qiáng)，當(dāng)ALA濃度為0.500 mmol/L時抑制作用最明顯。RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，隨著ALA濃度增大，CollagenⅢ mRNA水平和蛋白表達(dá)水平逐漸下降，當(dāng)ALA溶液濃度達(dá)到0.500 mmol/L時下降至最低值。結(jié)論ALA-PDT能有效抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，抑制作用在ALA濃度為0.500 mmol/L時最強(qiáng)。ALA-PDT可能是通過抑制瘢痕成纖維細(xì)胞中CollagenⅢ的合成，進(jìn)而抑制瘢痕疙瘩的形成。

5-氨基酮戊酸光動力療法；瘢痕成纖維細(xì)胞；膠原蛋白Ⅲ

瘢痕疙瘩是一種局部皮膚組織的良性纖維增生性疾病，是遺傳易感個體的皮膚組織對于損傷產(chǎn)生病理性傷口愈合反應(yīng)的產(chǎn)物，并以成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（特別是膠原蛋白）的大量堆積為主要特征[1]。目前，雖然治療瘢痕疙瘩的藥物和方法有很多，但療效有限，同時可能引起明顯的不良反應(yīng)和較高的復(fù)發(fā)率[2]。因此，尋找療效好、不良反應(yīng)率和復(fù)發(fā)率低的治療方法意義重大。

光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是在光敏劑的參與下，運用非熱能激光照射，引起光敏劑和氧的相互作用，產(chǎn)生活性氧和自由基，從而誘導(dǎo)組織損傷的治療方法[3]。5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，ALA）由甘氨酸、琥珀酸、輔酶A在ALA合成酶作用下合成，其本身并不是一種光敏劑，是體內(nèi)合成亞鐵血紅素的前體物質(zhì)，但在細(xì)胞內(nèi)一些酶的作用下可轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)光敏作用的原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）[4]。ALA-PDT 已在皮膚性疾病領(lǐng)域得到越來越廣泛地應(yīng)用，特別是在皮膚病毒疣及皮膚腫瘤等方面具有較好的療效。近年來，有研究證實[5]，ALA-PDT對于瘢痕組織具有一定的療效，陳金波等[6]通過研究發(fā)現(xiàn)光動力治療病理性瘢痕有效率與糖皮質(zhì)激素局部注射治療差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但無糖皮質(zhì)激素治療的不良反應(yīng)；焦健等[7]通過研究認(rèn)為ALA-PDT可能是通過Akt途徑上調(diào)程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)了異常增殖的成纖維細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮治療作用；孔祥明等[8]ALA-PDT干預(yù)裸鼠瘢痕疙瘩模型，觀察到瘢痕疙瘩內(nèi)成纖維細(xì)胞、膠原纖維均減少，瘢痕體積亦縮小，但其最佳的作用條件以及具體的作用機(jī)制尚不明確。

為此，本研究運用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測ALA-PDT對瘢痕成纖維細(xì)胞的作用，實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）和Western blot方法檢測ALA-PDT處理后成纖維細(xì)胞中膠原蛋白Ⅲ（CollagenⅢ）的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探討ALA-PDT治療瘢痕疙瘩的可能機(jī)制，為臨床運用ALA-PDT治療瘢痕疙瘩提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

羊抗人CollagenⅢ單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，羊抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗羊IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ALA購自美國Sigma公司，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit RT試劑盒購自日本TaKaRa公司，CCK8購自日本Dojindo公司。

1.2 組織來源和細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 瘢痕成纖維細(xì)胞來源 切取外傷后1～2年經(jīng)過病理檢查證實的瘢痕疙瘩，未使用任何干預(yù)治療，并經(jīng)患者知情同意。切取后即放置于無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液的50 ml離心管中，放入冰盒中保存。

1.2.2 瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng) 去除離心管內(nèi)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.25%氯霉素溶液和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）反復(fù)沖洗，去除瘢痕組織內(nèi)的血凝塊，小心剪除脂肪。將瘢痕組織剪成1 mm寬長條狀，PBS再次反復(fù)沖洗殘余凝血塊，放入15 ml離心管中，加入2.4μl/ml中性蛋白酶Ⅱ溶液，放置于4℃冰箱消化過夜。第2天取出離心管，吸去中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS沖洗2次，放入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，用眼科鑷子去除表皮組織并剪成1 mm3大小組織碎片后，置入50 ml離心管中，加入5倍體積的無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液配制的0.3%Ⅰ型膠原酶溶液，37℃輕微震蕩消化2～3 h，以200目金屬濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用10%胎牛血清的DMEM溶液重懸，血球計數(shù)板細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液種于10 cm培養(yǎng)皿。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含1%青、鏈霉素），37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 實驗分組及處理

將所培養(yǎng)的生長狀態(tài)無明顯差異的瘢痕成纖維細(xì)胞接種于96孔板和6孔板，分為8組，包括空白對照組（A組），PBS組（B組），以及6個ALA培養(yǎng)液組（C、D、E、F、G和H）。A組只給予含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，B組給予10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和PBS處理，6個ALA培養(yǎng)液組分別給予含 0.0625（C 組）、0.125（D 組）、0.250（E 組）、0.500（F 組）、1.000（G 組）和 2.000 mmol/L（H 組）ALA培養(yǎng)液的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。5 h后，每組給予635 nm LED激光器照射10 min后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。96孔板細(xì)胞用于CCK-8檢測成纖維細(xì)胞增殖抑制率。6孔板細(xì)胞用于提取CollagenⅢRNA和蛋白。

1.4 ALA-PD T對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力的影響

向96孔板中每孔加入10μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值。各藥物濃度組的生長抑制率（%）=（1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值）×100%。

1.5 引物設(shè)計、R N A提取和R T-PC R

1.5.1 引物設(shè)計 RT-PCR引物采用Premier 5.0軟件設(shè)計，由上海生工生物工程股份有限公司合成，CollagenⅢ正向引物：5'-AGTAGCAGTAGGAGGACT CGCAGG-3'，反向引物：5'-GAAGCCTCTGTGTCCTTT CA-TACC-3'，引物長度24bp，擴(kuò)增片段長度227bp；內(nèi)參GAPDH正向引物：5'-ACCACAGTCC-ATGCC ATCAC-3'，反向引物：5'-TCCACCACCCTGTT-GCTGTA-3'，擴(kuò)增片段長度 450 bp。

1.5.2 RNA提取和RT-PCR 按照Trizol抽提說明書抽提各待測組細(xì)胞中總RNA。CollagenⅢ與內(nèi)參基因GAPDH同管擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，維持35個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后應(yīng)用凝膠分析軟件分析目標(biāo)條帶的凈吸光度值。

1.6 W est ern bl ot檢測

胰蛋白酶消化培養(yǎng)瓶中不同組的成纖維細(xì)胞，用含血清培養(yǎng)基終止消化，離心，去上清，加入PBS洗細(xì)胞3次，加入裂解緩沖液，冰上放置20 min，收集裂解液，離心，12 000 r/min，吸取上清，紫外線分光光度儀測定各待測樣品濃度，分裝，冷凍保存在-80℃冰箱備用。將變性后的各蛋白樣品50μg/孔上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉（TBST配制）中封閉。應(yīng)用TBST洗膜后進(jìn)行免疫檢測：一抗（分別為1∶1 000羊抗人GAPDH和1∶400羊抗人CollagenⅢ）抗體室溫孵育過夜，TBST洗膜3次后加入二抗（分別為辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶40 000兔抗羊IgG）抗體室溫孵育1 h。TBST洗膜后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色曝光。分析各條帶凈吸光度值，并以GAPDH作為內(nèi)參，計算各蛋白樣品與GAPDH比值作為CollagenⅢ蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗或Dunnett t3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

成熟的瘢痕成纖維細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞間以細(xì)長突起交互相連，細(xì)胞飽滿，邊界清晰，貼壁良好，立體感強(qiáng)，胞漿豐富、均勻，細(xì)胞核清晰，呈圓形或類圓形，核內(nèi)染色質(zhì)均勻。經(jīng)635 nm LED激光器照射后10 min的A組和B組細(xì)胞形態(tài)上比較無明顯變化。6個不同濃度的ALA培養(yǎng)液組每組給予635 nm LED激光器照射10 min后，成纖維細(xì)胞皺縮呈類球樣改變，部分細(xì)胞膜、細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)容物溢出，細(xì)胞核縮小或碎裂，胞漿內(nèi)有大小不等顆粒樣物，出現(xiàn)空泡樣改變，各結(jié)構(gòu)模糊（見圖1）。

2.2 ALA-PD T抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖

如表1和圖2所示，ALA-PDT能明顯抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，抑制作用隨著ALA濃度增加逐漸增強(qiáng)（P＜0.05），且ALA濃度達(dá)到0.500 mmol/L時，其抑制作用達(dá)到高峰，其后抑制作用不再隨著ALA濃度增加而增強(qiáng)。F組與C、D、E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.807、6.800 和 3.151，P=0.000、0.001和0.008）；G組與C、D、E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.099、7.092 和 3.443，P=0.000、0.001 和 0.005）；H組與C、D、E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.280、7.273 和 3.623，P=0.000、0.001 和 0.003）；F組與G、H組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.473和0.292，P=0.645和0.775）；G組與H組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.181，P=0.860）。

2.3 C ol l agenⅢm R N A水平

圖1 不同濃度ALA-PD T對瘢痕成纖維細(xì)胞狀態(tài)的影響 （光學(xué)顯微鏡×200）

表1 ALA-PD T對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力的影響

圖2 不同濃度ALA-PD T對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力的影響 （±s）

如表2與圖3顯示，CollagenⅢ和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶與預(yù)期一致，ALA-PDT處理后的成纖維細(xì)胞中CollagenⅢmRNA水平低于A組和B組。且隨著ALA溶液濃度增加，CollagenⅢmRNA的水平逐漸下降（與A組和B組相比，P＜0.05）；當(dāng)ALA溶液濃度達(dá)到 0.500 mmol/L時，CollagenⅢmRNA水平達(dá)到最低值，但其后不再隨著ALA濃度增加而下降。CollagenⅢ mRNA：C、D、E、F、G、H 組分別與A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.943、4.294、5.326、10.076、10.340 和 10.244，P=0.007、0.002、0.000、0.000、0.000 和 0.000）；C、D、E、F、G、H組分別與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.271、3.623、4.654、9.405、9.668 和 9.572，P=0.022、0.002、0.002、0.000、0.000和 0.000）；F 組與C、D、E 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.133、5.782 和 4.750，P=0.000、0.000和 0.002）；G 組與 C、D、E 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.397、6.046 和 5.014，P=0.000、0.000和0.001）；H組與 C、D、E 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.301、5.950 和 4.918，P=0.000、0.000 和0.002）；F組與G、H組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.264和 0.168，P=0.795和 0.869），G 組與 H 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.096，P=0.925）。

2.4 C ol l agenⅢ蛋白的表達(dá)

如表2與圖4顯示，CollagenⅢ和GAPDH電泳結(jié)果也與real-time PCR相似，ALA-PDT處理后的成纖維細(xì)胞中CollagenⅢ蛋白表達(dá)低于空白組和PBS組，且隨著ALA溶液濃度增加，CollagenⅢ蛋白表達(dá)逐漸減弱（與A組和B組相比，P＜0.05）；當(dāng)ALA溶液濃度達(dá)到0.500 mmol/L時，CollagenⅢ蛋白表達(dá)水平達(dá)到最低值，但其后不再隨著ALA濃度增加而減弱。CollagenⅢ蛋白 C、D、E、F、G、H 組分別與A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.224、2.289、2.306、2.489、2.582 和 2.544，P=0.042、0.035、0.027、0.024、0.020 和 0.022）；C、D、E、F、G、H 組分別與 B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.324、2.405、2.471、2.877、2.969 和 2.932，P=0.031、0.029、0.025、0.011、0.009和0.010）；F組與 C、D、E 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué) 意 義（t=2.416、2.265 和 2.136，P=0.028、0.033 和0.047）；G 組與C、D、E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.508、2.807 和 2.481，P=0.023、0.017 和 0.026）；H組與C、D、E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.471、2.771 和 2.461，P=0.025、0.019 和 0.026）；F 組分別與G、H組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.092和0.055，P=0.928和 0.957），G 組與H組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.037，P=0.971）。

表2 Collagen I I I基因mR N A與蛋白的相對表達(dá)量 （±s）

表2 Collagen I I I基因mR N A與蛋白的相對表達(dá)量 （±s）

組別CollagenⅢ蛋白A組 0.732±0.076 0.261±0.083 B組 0.704±0.015 0.282±0.054 C組 0.651±0.037 0.257±0.078 D組 0.553±0.039 0.219±0.041 E組 0.510±0.056 0.184±0.074 F組 0.312±0.041 0.126±0.036 G組 0.301±0.054 0.121±0.082 H組 0.305±0.065 0.123±0.065 F值 12.514 8.471 P值 0.020 0.010 CollagenⅢmRNA

圖3 不同濃度ALA-PD T處理對成纖維細(xì)胞中C ol l agenⅢm R N A表達(dá)的影響

圖4 不同濃度ALA-PD T處理對成纖維細(xì)胞中C ol l agenⅢ蛋白表達(dá)的影響

3 討論

瘢痕疙瘩是由于損傷部位成纖維細(xì)胞過度活躍，真皮層膠原生成導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)堆積引起[9]。研究表明，瘢痕組織內(nèi)主要含有膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ以及少量其他型膠原蛋白[10]。臨床上，瘢痕疙瘩的生物學(xué)行為與良性腫瘤相似，可越過損傷邊緣影響周圍健康組織，并難以治療。

PDT是目前治療皮膚性疾病的常見治療方式。這種治療方法通常與光敏劑相互作用，促進(jìn)后者在目的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為PpIX。PpIX在包含高度增殖細(xì)胞的組織內(nèi)合成增加，這可能與血色素合成酶活性改變有關(guān)，它不僅與惡性細(xì)胞的生物學(xué)行為有關(guān)，而且與侵襲行為或者腫瘤細(xì)胞其他相似活性的非腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為有關(guān)。雖然瘢痕疙瘩是一種良性的纖維細(xì)胞增殖性紊亂，但是其具有臨床侵襲性并在治療后容易復(fù)發(fā)。ALA是第2代光敏劑，進(jìn)入人體后可被增生的細(xì)胞選擇性吸收，在細(xì)胞內(nèi)某些酶的作用下轉(zhuǎn)化為PpIX等物質(zhì)，進(jìn)而在特殊光的照射下生成活性氧造成細(xì)胞損傷。

本組實驗結(jié)果顯示與A組和B組比較，ALA組內(nèi)CollagenⅢ的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降。提示ALA-PDT可能通過抑制CollagenⅢ的合成，從而抑制瘢痕疙瘩的形成和發(fā)展。ALA-PDT在瘢痕疙瘩組織中產(chǎn)生的活性氧和自由基可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和酶的巰基氧化形成二硫鍵，氨基酸殘基氧化，胞漿及膜蛋白和某些酶交聯(lián)形成而具體或者更大的聚合物。一方面合成膠原蛋白相關(guān)酶的活性受到抑制，膠原蛋白合成減少，另外細(xì)胞膜膠原蛋白功能發(fā)生改變并缺少能量，使成纖維細(xì)胞內(nèi)合成的膠原蛋白無法轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外，進(jìn)而使細(xì)胞外基質(zhì)減少，致使膠原纖維結(jié)構(gòu)模糊、成纖維細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究ALA-PDT可通過抑制瘢痕疙瘩纖維細(xì)胞中CollagenⅢ的合成，進(jìn)而抑制瘢痕疙瘩的形成，ALA培養(yǎng)液的濃度達(dá)到0.500 mmol/L時，抑制作用達(dá)到高峰。這將有助于臨床選擇更為合適的ALA-PDT方案治療瘢痕疙瘩。

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（張蕾 編輯）

Impact of ALA-PDT on fibroblasts from keloid and its mechanism

Zhi-juan Zhu,Qi-ying Wang,Xiao-li Wang,Feng-min Song
(Department of Plastic Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

ObjectiveTo study the impact of 5-aminolevulinic acid based photodynamic therapy(ALA-PDT)on proliferation of fibroblasts from keloid and its mechanism for guiding the use of ALA-PDT treating keloid in clinic.MethodsFibroblasts from patients'keloid were primarily cultured,then those cells without significant difference in growth state were divided into control group,PBS group and 6 ALA groups.Each group

PDT of 635 nm light emitting diode(LED)laser irradiation.Cell counting kit-8(CCK-8)was used to detect the suppressive rate of ALA-PDT on the proliferation of the fibroblasts.RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein levels of Collagen III.ResultsCompared with the control and PBS groups,ALA-PDT inhibited the proliferation of fibroblasts and the suppressive rate was gradually enhanced with the increase of the ALA concentration.When the concentration of ALA was 0.500 mmol/L,the inhibition was the strongest.The levels of CollagenⅢmRNA and protein were decreased with the increase of the ALA concentration,and the levels of CollagenⅢmRNA and protein were the lowest when the concentration of ALA was 0.500 mmol/L.ConclusionsALA-PDT could inhibit the proliferation of fibroblasts from keloid and the inhibition would be the strongest at the ALA concentration of 0.500 mmol/L.The mechanism may be associated with the suppression of the synthesis of Collagen III in scar fibroblasts.

ALA-PDT;fibroblast;keloid;CollagenⅢ

R751

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.008

1005-8982（2017）13-0039-05

2016-12-12

王琪影，E-mail：drqqwang@163.com