姜慧君，賀漪

（湖北省武漢市第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,湖北 武漢 430022）

MicroR N A-20b在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)增殖和凋亡的影響*

姜慧君，賀漪

（湖北省武漢市第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,湖北 武漢 430022）

目的探討microRNA-20b（miR-20b）在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對(duì)增殖和凋亡的影響。方法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測(cè)定miR-20b在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)431、SKOV3及正常卵巢上皮細(xì)胞系Hose中的相對(duì)表達(dá)量，將SKOV3細(xì)胞系分成未轉(zhuǎn)染對(duì)照、陰性對(duì)照及miR-20b模擬物組，用Lipofectamine 2000分別不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染miR-20b scramble和miR-20b mimics，CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定3組細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定3組細(xì)胞凋亡，Western blot測(cè)定張力蛋白同源在10號(hào)染色體有缺失的磷酸酶（PTEN）、裂解型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果qRT-PCR示A431、SKOV3細(xì)胞系miR-20b相對(duì)表達(dá)量較Hose細(xì)胞系低；miR-20b模擬物組在0、24、48、72及96 h的OD45 nm值低于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和陰性對(duì)照組；miR-20b模擬物組凋亡率高于陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組；miR-20b模擬物組PTEN相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組，裂解型PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組。結(jié)論miR-20b抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)PTEN和上調(diào)PARP蛋白表達(dá)有關(guān)。

miR-20b;卵巢癌；增殖；凋亡

卵巢癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，在發(fā)達(dá)國(guó)家，年齡標(biāo)化發(fā)病率為十萬(wàn)分之9.1，年齡標(biāo)化死亡率為十萬(wàn)分之5.0；在發(fā)展中國(guó)家，年齡標(biāo)化發(fā)病率為十萬(wàn)分之5.0，年齡標(biāo)化死亡率為十萬(wàn)分之3.1[1]。在卵巢癌早期，經(jīng)手術(shù)、化療等綜合治療后，5年生存率可達(dá)90%，而對(duì)于晚期卵巢癌，5年生存率則降至50%[2]。目前，對(duì)于卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，深入研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)設(shè)計(jì)合理的藥物具有重要的意義。microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約19～22 nt的微小RNA，其通過(guò)與靶基因結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的負(fù)調(diào)控[3]，在腫瘤增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起著重要的作用[4]。microRNA-20b（miR-20b）屬于microRNA-17大家族中miRNA 106a-363 cluster亞家族成員[5]，miR-20b被報(bào)道參與調(diào)節(jié)骨肉瘤[6]、膀胱癌[7]、乳腺癌[8]、食管癌[9]、胃癌[10]的增殖、自噬、遷移和侵襲等腫瘤生物學(xué)過(guò)程。然而，miR-20b對(duì)卵巢癌的增殖和凋亡的影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究在體外研究miR-20對(duì)卵巢癌增殖和凋亡的影響，并揭示其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)431、SKOV3及正常卵巢上皮細(xì)胞系Hose（美國(guó)ATCC公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司），Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），Western blot所用一抗（美國(guó)BD公司），HRP標(biāo)記的二抗（美國(guó) Invitrogen公司），miR-20b mimics及scramble均由廣州銳博公司合成。Lipofectamine 2000 reagent（美國(guó)Invitrogen公司），ABI Prism 7700系統(tǒng)的SYBR Green Reagents（日本TaKaRa公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)431、SKOV3及正常卵巢上皮細(xì)胞系Hose加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后消化傳代。將卵巢癌SKOV3細(xì)胞系分成未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、陰性對(duì)照及miR-20b模擬物組，陰性對(duì)照組及miR-20b模擬物組采用Lipofectamine 2000 reagent分別轉(zhuǎn)染miR-20b scramble和miR-20b mimics，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組用PBS處理，作為空白對(duì)照，miR-20b模擬物組轉(zhuǎn)染序列：miR-20b mimics正向引物：5'-CAAAGUG CUCAUAGUGCAGGUAG-3'，miR-20b mimics 反向引物：5'-ACCUGCACUAUGAGCACUUUGUU-3’；陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染序列：miR-20b NC正向引物：5'-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3'，miR-20b NC 反向引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3 R N A提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

用All-in-One microRNA抽提試劑盒和All-in-One miRNA實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)試劑盒提取和分離miRNAs，ABI Prism 7700系統(tǒng)的 SYBR Green Reagents qRT-PCR，在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀中，以U6小核RNA作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法定量，量化miR-20b相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法，將3組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，在96孔板上以2×103個(gè)/孔接種，每孔培養(yǎng)基體積 200μl。在分別培養(yǎng) 0、24、48、72、96 h 后，每孔加入20μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制卵巢癌細(xì)胞增殖曲線。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

采用流式細(xì)胞術(shù)，用Annexin V/PI染色檢測(cè)，將3組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重懸，加入相應(yīng)比例的Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液以及PI染料，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例來(lái)確定細(xì)胞凋亡的變化。

1.6 Western blot

將陰性對(duì)照組和miR-20b模擬物組兩組細(xì)胞用RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min后，變性、上樣，以每孔30μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入10號(hào)染色體有缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin ho-molog deleted from chromosome 10，PTEN）、裂解型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]一抗，濃度為 1∶200，37℃孵育 4 h，二抗（1∶500）孵育過(guò)夜，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白測(cè)定值/GAPDH，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組間比較先行方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，再行LSD-t或SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m iR-20b在卵巢癌細(xì)胞系中低表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)miR-20b在A431細(xì)胞系中相對(duì)表達(dá)量為（0.300±0.050），在SKOV3細(xì)胞系中相對(duì)表達(dá)量為（0.100±0.020），在正常卵巢上皮細(xì)胞系Hose中相對(duì)表達(dá)量為1.000，提示3組間miR-20b的表達(dá)量經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=155.814，P=0.000）；A431 細(xì)胞系中 miR-20b 相對(duì)表達(dá)量與Hose細(xì)胞系比較，行LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=-0.700，P=0.000），A431 細(xì)胞系中miR-20b相對(duì)表達(dá)量低于正常卵巢上皮細(xì)胞系Hose；SKOV3細(xì)胞系中 miR-20b相對(duì)表達(dá)量與Hose細(xì)胞系比較，行LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.900，P=0.000），SKOV3細(xì)胞系中 miR-20b相對(duì)表達(dá)量低于正常卵巢上皮細(xì)胞系Hose。見(jiàn)圖1。

2.2 m iR-20b過(guò)表達(dá)抑制SKO V3細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-20b模擬物24 h后，qRT-PCR示，miR-20b模擬物組的miR-20b表達(dá)量是（45±2.800），陰性對(duì)照組為1.000，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為1.000，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.389，P=0.000）；miR-20b模擬物組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.872，P=0.000），miR-20b 模擬物組miR-20b相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組，提示轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)圖2A。

轉(zhuǎn)染后0 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（0.330±0.030），陰性對(duì)照組為（0.350±0.040），未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（0.390±0.030），3組OD 450 nm值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.471，P=0.164）。

圖1 m iR-20b在卵巢癌及正常卵巢上皮細(xì)胞系中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后24 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（0.430±0.080），陰性對(duì)照組為（0.750±0.100），未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（0.700±0.100），3組OD 450 nm值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=10.102，P=0.012）；MiR-20b 模擬物組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.320，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.270，P=0.000）。

轉(zhuǎn)染后48 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（0.720±0.090），陰性對(duì)照組為（1.670±0.250），未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（1.570±0.200），3組OD 450 nm值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.175，P=0.001）；MiR-20b模擬物組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.950，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.850，P=0.000）。

轉(zhuǎn)染后72 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（1.230±0.150），陰性對(duì)照組為（2.430±0.190），未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（2.5±0.1），3組OD 450 nm值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.862，P=0.000）；MiR-20b模擬物組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.200，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.270，P=0.000）。

圖2 m iR-20b過(guò)表達(dá)抑制SKO V3細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染后96 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（1.720±0.200），陰性對(duì)照組為（3.780±0.320），未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（4.080±0.270），3組OD 450 nm值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.996，P=0.000），miR-20b模擬物組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.060，P=0.000）；與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.360，P=0.000）。miR-20b模擬物組在轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h OD450 nm值低于陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。見(jiàn)圖2B。

2.3 m iR-20b過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡率，示miR-20b模擬物組的凋亡率為（20.150±1.200）%，陰性對(duì)照組為（4.000±0.700）%，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（2.800±0.500）%，3組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=387.581，P=0.000），miR-20b模擬物組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.150，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.350，P=0.000），miR-20b模擬物組凋亡率高于陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。見(jiàn)圖3。

2.4 m iR-20b抑制增殖并促進(jìn)凋亡的機(jī)制

Western blot檢測(cè)了PTEN蛋白和與凋亡發(fā)生相關(guān)的蛋白 Cleaved PARP，miR-20b模擬物組PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.370±0.030），陰性對(duì)照組為1.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-36.370，P=0.000），miR-20b模擬物組PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組；miR-20b模擬物組Cleaved PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量為（3.500±0.120），陰性對(duì)照組為1.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=36.080，P=0.000），miR-20b模擬物組Cleaved PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組。見(jiàn)圖4。

圖3 m iR-20b過(guò)表達(dá)促進(jìn)SKO V3細(xì)胞凋亡

圖4 m iR-20b下調(diào)PTEN、上調(diào)PAR P的表達(dá)

3 討論

卵巢癌是起源于卵巢上皮的惡性腫瘤，依據(jù)病理類(lèi)型可分為卵巢肉瘤和漿液性卵巢癌，96%～99%為漿液性卵巢癌，先手術(shù)再化療比單獨(dú)手術(shù)或者單獨(dú)化療效果更佳，但卵巢癌預(yù)后仍較差，據(jù)報(bào)道Ⅳ期卵巢癌5年生存率僅20.3%[11]。在腫瘤演進(jìn)的過(guò)程中，會(huì)涉及到一系列重要的分子或信號(hào)通路變異，包括 EMT[12]、miRNA[13]、LncRNA[14]、P21[15]、P53[16]等分子。

miRNA是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體，經(jīng)過(guò)Dicer加工之后一類(lèi)非編碼的小RNA分子（18～25個(gè)核苷酸），通過(guò)與靶基因的種子區(qū)序列相互配對(duì)抑制其基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯行使其功能，廣泛存于真核生物體中[17]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，多種miRNA發(fā)生表達(dá)異常，并廣泛參與了增殖、凋亡、自噬、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程。比如：miR-124被報(bào)道在結(jié)腸癌細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，通過(guò)下調(diào)ROCK1蛋白表達(dá)，miR-124抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。Wnt/b-catenin信號(hào)通路激活miR-30a-5p并通過(guò)抑制NCAM表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲[19]。miR-20b在腫瘤中所起的作用不盡相同，在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中，miR-20b較正常骨組織和細(xì)胞系下調(diào)表達(dá)，miR-20b可靶向調(diào)節(jié)HIF-1a的表達(dá)，上調(diào)miR-20b可抑制HIF-1a的表達(dá)，下調(diào)VEGF信號(hào)通路蛋白，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，是個(gè)抑癌基因[6]。在膀胱癌中，miR-20b在膀胱癌細(xì)胞系中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-20b抑制膀胱癌細(xì)胞系EJ的增殖，通過(guò)下調(diào)cyclin D1，CDK2和CDK6的表達(dá)，誘導(dǎo)G1細(xì)胞周期阻滯，并抑制膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲，起抑癌基因的作用[7]。在甲狀腺乳頭狀癌中，miR-20b低表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，上調(diào)miR-20b表達(dá)通過(guò)抑制MAPK/ERK信號(hào)通路抑制甲狀腺K1和TPC-1細(xì)胞系活動(dòng)性和遷移侵襲能力，起抑癌基因的作用[20]。與之相反，在乳腺癌中，miR-20b在乳腺癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，且miR-20b可與PTEN 3"UTR靶向結(jié)合，上調(diào)miR-20b可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成，起促癌基因的作用[8]。miR-20b在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的病人中的表達(dá)水平較無(wú)腦轉(zhuǎn)移的病人要高[21]，在胃癌中，miR-20b在胃癌組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征相關(guān)，起促癌基因的作用[10]。在食管癌中，miR-20b高表達(dá)于食管癌組織和細(xì)胞，且通過(guò)靶向結(jié)合PTEN 3'-UTR而促進(jìn)食管癌增殖、遷移和侵襲，為促癌基因[9]。在肝癌中，miR20b上調(diào)表達(dá)，且與肝癌預(yù)后差相關(guān)[22]。

在本研究中，miR-20b在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)431、SKOV3的相對(duì)表達(dá)量較正常卵巢上皮細(xì)胞系降低，通過(guò)對(duì)SKOV3細(xì)胞系外源性轉(zhuǎn)染miR-20b mimics后，發(fā)現(xiàn)miR-20b模擬物組的miR-20b相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和陰性對(duì)照組升高，表示轉(zhuǎn)染成功；進(jìn)一步采用CCK-8法測(cè)定3組細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)miR-20b模擬物組OD450 nm值低于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，提示miR-20b可抑制SKOV3細(xì)胞增殖。對(duì)miR-20b模擬物組、未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡，發(fā)現(xiàn)miR-20b組凋亡率高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組，表明miR-20b可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，表明在卵巢癌中，miR-20b起抑癌基因的作用，這與骨肉瘤、膀胱癌、甲狀腺癌中的結(jié)果一致，而與乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌中所起的作用相反。

PTEN分子是被廣泛研究的抑癌分子，其在多種腫瘤中缺乏表達(dá)[23]，其通過(guò)對(duì)磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇（PIP3）脫磷酸化負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，最終參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡、遷移和侵襲等腫瘤生物學(xué)過(guò)程[24]。LI等[25]報(bào)道m(xù)iR-20b可靶向調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)，且miR-20b上調(diào)可抑制PTEN蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌腫瘤發(fā)生。ZHU等[26]在結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)miR-20b可靶向下調(diào)PTEN的表達(dá)，在乳腺癌中，ZHOU等[8]通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-20b與PTEN靶向結(jié)合，并通過(guò)下調(diào)PTEN表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系ZR-75-30和MCF-7增殖和克隆形成。在本研究中，miR-20b模擬物組PTEN相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組低，miR-20b抑制增殖的機(jī)制可能與miR-20b下調(diào)PTEN表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡的通路主要包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑，外源性途徑由腫瘤壞死因子受體1、Fas/CD95、DR3和TRAIL-R1等死亡受體介導(dǎo)，進(jìn)而激活caspase-3、8誘導(dǎo)凋亡[20]；內(nèi)源性途徑，即線粒體途徑，主要通過(guò)激活 caspase-3、8、9，PARP，并將DNA裂解為180～200 bp大小的片段，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[27]，PARP剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，被認(rèn)為是Caspase 3激活的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b模擬物組裂解型PARP表達(dá)量高于陰性對(duì)照組，提示miR-20b誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與PARP升高有關(guān)，為內(nèi)源性通路所介導(dǎo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在卵巢癌細(xì)胞系中低表達(dá)，且上調(diào)miR-20b的表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與PTEN下調(diào)、PARP上調(diào)有關(guān)，這更深入的闡明了卵巢的發(fā)病機(jī)制，可能成為卵巢癌治療的新治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

[1]TORRE L A,BRAY F,SIEGEL R L,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA:a Cancer Journal for Clinicians,2015,65(2):87-108.

[2]DINKELSPIEL H E,CHAMPER M,HOU J,et al.Long-term mortality among women with epithelial ovarian cancer[J].Gynecologic Oncology,2015,138(2):421-428.

[3]LEE R C,AMBROS V.An extensive class of small RNAs in caenorhabditis elegans[J].Science,2001,294(5543):862-864.

[4]KROL J,LOEDIGE I,FILIPOWICZ W.The widespread regulation of microRNA biogenesis,function and decay[J].Nature Reviews Genetics,2010,11(9):597-610.

[5]TANZER,A,STADLER,P.F.Molecular evolution of a microRNA cluster[J].J.Mol.Biol,339(2):327-335.

[6]LIU M,WANG D,LI N.MicroRNA-20b Downregulates HIF-1α and inhibits the proliferation and invasion of osteosarcoma cells[J].Oncology Research Featuring Preclinicaland ClinicalCancer Therapeutics,2016,23(5):257-266.

[7]PARK S L,CHO T M,WON S Y,et al.MicroRNA-20b inhibits the proliferation,migration and invasion of bladder cancer EJ cells via the targeting of cell cycle regulation and Sp-1-mediated MMP-2 expression[J].Oncology Reports,2015,34(3):1605-1612.

[8]ZHOU W,SHI G,ZHANG Q,et al.MicroRNA-20b promotes cell growth of breast cancer cells partly via targeting phosphatase and tensin homologue(PTEN)[J].Cell&Bioscience,2014,4(1):1.

[9]WANG B,YANG J,XIAO B.MicroRNA-20b(miR-20b)Promotes the proliferation,migration,invasion,andtumorigenicityin esophageal cancer cells via the regulation of phosphatase and tensin homologue expression[J].PloS One,2016,11(10):e0164105.

[10]XUE T,LI-DE TAO M Z,XU G,et al.miR-20b overexpression is predictive of poor prognosis in gastric cancer[J].Onco-Targets and Therapy,2015,8:1871.

[11]GEORGE E M,HERZOG T J,NEUGUT A I,et al.Carcinosarcoma of the ovary:natural history,patterns of treatment,and outcome[J].Gynecol Oncol,2013,131(1):42-44.

[12]劉芃芃,陳永孜,任秀寶,等.肝細(xì)胞肝癌NTS的表達(dá)與炎癥微環(huán)境形成和腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及預(yù)后的相關(guān)性研究 [J].中國(guó)腫瘤臨床,2013,40(19):1150-1154.

[13]宋世鐸,周健,何宋兵,等.miRNA-375對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1增殖和凋亡的影響[J].中國(guó)腫瘤臨床,2013,40(1):21-24.

[14]徐天蔚,王朝霞.長(zhǎng)鏈非編碼RNA與胃癌診斷預(yù)后及耐藥性研究進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤臨床,2015,42(1):71-76.

[15]王飛,李建國(guó),吳巧斌,等.P21活化激酶6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2015,25(28):7-11.

[16]郝玉琴,康春義,張?chǎng)?等.人A431皮膚鱗狀細(xì)胞癌中絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路對(duì)P53的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2016,26(1):24-29.

[17]IAVELLO A,FRECH V S L,GAI C,et al.Role of Alix in miRNA packaging during extracellular vesicle biogenesis[J].Int J Mol Med,,2016,37(4):958-966.

[18]ZHOU L,XU Z,REN X,et al.MicroRNA-124(MiR-124)inhibits cellproliferation,metastasisand invasion in colorectal cancer by downregulating Rho-associated protein kinase 1(ROCK1)[J].Cellular Physiology and Biochemistry,2016,38(5):1785-1795.

[19]WANG Z,DAI X,CHEN Y,et al.MiR-30a-5p is induced by Wnt/β-catenin pathway and promotes glioma cell invasion by repressingNCAM [J].Biochemicaland BiophysicalResearch Communications,2015,465(3):374-380.

[20]HONG S,YU S,LI J,et al.MiR-20b displays tumor-suppressor functions in papillary thyroid carcinoma by regulating the MAPK/ERK signaling pathway[J].Thyroid,2016,26(12):1733-1743.

[21]AHMAD A,GINNEBAUGH K R,SETHI S,et al.miR-20b is up-regulated in brain metastases from primary breast cancers[J].Oncotarget,2015,6(14):12188.

[22]XUE T,TAO L,ZHANG M,et al.Clinicopathological Significance of MicroRNA-20b expression in hepatocellular carcinoma and regulation of HIF-1α and VEGF effect on cell biological behaviour[J].Disease Markers,2015(3):325176.

[23]LI J,YEN C,LIAW D,et al.PTEN,a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain,breast,and prostate cancer[J].Science,1997,275:1943-1947.

[24]CHALHOUB N,BAKER S J.PTEN and the PI3-kinase pathway in cancer[J].Annual Review of Pathology,2009,4:127.

[25]LI D,ILNYTSKYY Y,KOVALCHUK A,et al.Crucial role for early growth response-1 in the transcriptionalregulation of miR-20b in breast cancer[J].Oncotarget,2013,4(9):1373-1387.

[26]ZHU J,CHEN L,ZOU L,et al.MiR-20b,-21,and-130b inhibit PTEN expression resulting in B7-H1 over-expression in advanced colorectal cancer[J].Human Immunology,2014,75(4):348-353.

[27]TAIT S W G,GREEN D R.Mitochondrial regulation of cell death[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,2013,5(9):a008706.

[28]MCILWAIN D R,BERGER T,MAK T W.Caspase functions in cell death and disease[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,2013,5(4):a008656.

（張蕾 編輯）

Expression of miR-20b in ovarian carcinoma cell line and its effect on proliferation and apoptosis*

Hui-jun Jiang,Yi He
(Department of Gynecology and Obstetrics,Wuhan No.1 Hospital,Wuhai,Hubei 430022,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-20b in ovarian carcinoma cell line and its effect on proliferation and apoptosis.MethodsThe relative expression levels of miR-20b in A431,SKOV3 and Hose cell lines were measured by qRT-PCR.The SKOV3 cell line was divided into non-transfection control group without transfection,negative control group transfected with miR-20b scramble and miR-20b mimics group transfected with miR-20b mimics by Lipofectamine 2000.The proliferation ability was tested by CCK8 assay.The apoptosis rate was measured by flow cytometry.The expression levels of phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10(PTEN)and cleaved poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)were measured by Western blot.ResultsThe expression levels of miR-20b in the A431 and SKOV3 cell lines were significantly lower than that in the Hose cell line.The value of OD 450 nm in the miR-20b mimics group was significantly lower than that in the non-transfection control and negative control groups at 0,24,48,72 and 96 h.The apoptosis rate of the miR-20b mimics group was significantly higher than that of the negative control and non-transfection control groups.Compared to the negative control group,the expression level of PTEN was down-regulated and the cleaved PARP was up-regulated in the miR-20b mimics group.ConclusionsmiR-20b inhibits proliferation and promotes apoptosis of ovarian carcinoma cells,the mechanism may be associated with down-regulation of PTEN and up-regulaton of cleaved PARP.

miR-20b;ovarian carcinoma cell;proliferation;apoptosis

R737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.007

1005-8982（2017）13-0033-06

2016-12-10

武漢市衛(wèi)計(jì)委課題（No：WX15C32）

賀漪，E-mail：heyi879@126.com