宋小紅，李承旭，吳揚，蔡源，董俊武

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 武漢 430034）

百里醌預(yù)處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響

宋小紅，李承旭，吳揚，蔡源，董俊武

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 武漢 430034）

目的探討百里醌對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制。方法隨機(jī)將60只雄性SD大鼠分成假手術(shù)組（Sham組）、腎缺血再灌注損傷組（IRI組）和百里醌不同濃度預(yù)處理組（Thy組）。IRI組和Thy組用無創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)腎蒂復(fù)制IRI模型，Sham組操作同上，但不夾閉左側(cè)腎蒂。Thy組在缺血前45 min給予百里醌5、10、20和40 mg/kg腹腔注射。Sham組和IRI組在同一時間給予等體積生理鹽水腹腔注射。再灌注24 h后處死小鼠，收集血清和腎臟標(biāo)本。PAS染色檢測腎臟病理改變，ELISA檢測尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)、白細(xì)胞介素8（IL-8）、干擾素（IFN-γ）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的表達(dá),Western blot檢測JAK2、STAT3、P-JAK2、P-STAT3、P53和P21蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測IL-8、IFN-γ和TNF-α的信使RNA 水平（mRNA）。結(jié)果缺血再灌注損傷增加 BUN、Cr、P-JAK2、P-STAT3、P53、P21、MDA、IL-8、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)以及腎組織病理改變，同時減少CAT、GPX與SOD表達(dá)。而百里醌治療，可減少BUN、Cr、P-JAK2、P-STAT3、P53、P21、MDA、IL-8、IFN-γ 和 TNF-α 表達(dá)以及腎組織病理改變，增加 CAT、GPX 與SOD表達(dá)，3組之間JAK2和STAT3表達(dá)無差異。結(jié)論百里醌預(yù)處理可減輕腎缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制部分是通過抑制JAK2/STAT3/P53信號通路介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激。

百里醌；腎缺血再灌注損傷；炎癥；氧化應(yīng)激；JAK2/STAT3/P53

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是臨床上常見的危重癥，好發(fā)于腎移植、腎部分切除術(shù)、心臟手術(shù)和膿毒癥等危重情況。其發(fā)病率和死亡率奇高，據(jù)報道，全世界AKI每年發(fā)病率為1330萬，與AKI相關(guān)的死亡率為200萬[1-2]。腎臟缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，IRI）是導(dǎo)致 AKI的主要原因，并嚴(yán)重影響病情的轉(zhuǎn)歸[3]。百里醌（Thymoquinone，Thy）是從Nigella sativa植物提取的一種物質(zhì)，具有抗凋亡、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫以及抗氧化應(yīng)激的活性[4-5]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，Thy對腦、肝臟、腸等器官缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[6-9]。本實驗擬在動物水平探討Thy預(yù)處理對炎癥和氧化應(yīng)激的影響以及相關(guān)機(jī)制，為臨床防治IRI提供理論和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和動物

百里醌（上海哈森公司），無水乙醇（美國Sigma公司），水合氯醛（Google生物）。JAK2、P-JAK2、P-STAT3、STAT3（均美國 CST 公司），P53和 P21（美國 abgent公司），TRIzol reagent（美國 Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國GeneCopoeia公司），RT-PCR引物（擎科生物技術(shù)有限公司，訂單號SY14032221，序列見表1），PAS試劑由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理實驗室配制。紫外分光光度計（美國Thermo fisher）、逆轉(zhuǎn)錄儀（德國 Eppendorf）、RT-PCR 儀（美國 BIO-RAD IQ5）、顯微鏡（日本 Olympus BX51）及成像系統(tǒng)（日本HITMAS-30）均為同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供。SD大鼠，購自武漢大學(xué)實驗動物中心，SPF級，質(zhì)量合格證號430121021，飼養(yǎng)于同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，許可證號SYXK（鄂）2011-0027，設(shè)施使用證號00124722。

1.2 動物模型的復(fù)制與分組

60只健康雄性SD大鼠，平均體重220～250克。隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組），腎缺血再灌注損傷組（IRI組）和百里醌不同濃度組（Thy組）。Thy組在缺血前45 min給予 Thy 5、10、20和 40 mg/kg腹腔注射。Sham組和IRI組在同一時間給予等體積生理鹽水腹腔注射。IRI組和Thy組用無創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)腎蒂構(gòu)建IRI模型，Sham組操作同上，但不夾閉左側(cè)腎蒂。具體手術(shù)方式見參考文獻(xiàn)[9]。

1.3 標(biāo)本收集

再灌注24h后，行腹主動脈取血，室溫下3000r/min離心10 min后取上清液送同濟(jì)醫(yī)院檢驗科檢測血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（Creatinine，Cr）。開腹取左腎；1/3左腎置于多聚甲醛做石蠟切片，其余組織冷凍保存于-80°冰箱。

1.4 腎臟病理檢查

取腎臟石蠟包塊，4μm切片，脫蠟透明后由同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科實驗室PAS試劑進(jìn)行染色，光鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)，半定量計數(shù)方法評估損傷程度，分別根據(jù)腎小管上皮細(xì)胞壞死、腎小管擴(kuò)張、刷狀緣脫落、管型等分級，5級評分如下：0分，正常；1分，＜25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，＞75%。每只小鼠切片至少隨機(jī)選擇10個腎皮髓交界處視野（×400）[9]。見表 1。

1.5 Western blot測定 JAK2、STAT3、P-JAK2、P-STAT3、P53和P21的蛋白表達(dá)

取腎組織，加入裂解液，勻漿，收集上清液，蛋白定量后變性，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉1 h，4℃下一抗封閉過夜；37℃下二抗孵育1 h，ECL發(fā)光，X線片顯影、定影，凝膠圖像系統(tǒng)分析灰度值。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測腎組織中白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子和干擾素表達(dá)水平

表1 引物序列

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 法檢測腎臟白細(xì)胞介素8（IL-8），腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor-α，TNF-α） 和干擾素（inteferon gamma，IFN-γ）的信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)水平。稱取適量腎臟組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度。引物序列見表1。采用兩步法PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性30 s；95℃變性 5 s，60℃退火延伸1 min。共 40個循環(huán)，得到每個樣本的CT值法，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達(dá)量。

1.7 ELI SA檢測血清中I L-8、TN F-α、I FN-γ表達(dá)水平

按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中IL-8、TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平。

1.8 腎組織勻漿中丙二醛、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶含量檢測

按照ELISA試劑盒說明書測定腎組織丙二醛（Malondialdehyde，MDA），過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用頻數(shù)描述。計量資料組間比較采用方差分析，對等級資料使用非秩和檢驗（Kruskal-WallisH檢驗）進(jìn)行組間分析，兩兩比較則采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Thy預(yù)處理減輕腎缺血再灌注損傷

與Sham組比較，IRI組Cr和BUN表達(dá)增高（χ2=4.34和4.56，P=0.047和 0.045）。而 Thy組與IRI組比較，Cr和 BUN 均降低（χ2=4.17、4.88、5.25、5.56、6.16、6.54 和 5.72，P=0.048、0.041、0.036、0.029、0.013、0.025、0.011 和 0.021）。結(jié)果提示Thy預(yù)處理可以呈濃度依賴性減輕腎缺血再灌注損傷，在0～40 mg/kg范圍內(nèi)，Thy其最佳濃度為40 mg/kg。見表2。

2.2 Thy預(yù)處理可以減輕腎組織結(jié)構(gòu)的改變

與Sham組比較，IRI組腎小管明顯擴(kuò)張，大量腎小管細(xì)胞腫脹，空泡變性，壞死，刷狀緣脫落以及腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞大量浸潤，其損傷評分為（4.5±1.0）分，而Sham組為（1.0±0.5）分，這提示腎臟損傷增加（χ2＝11.34，P=0.004）。而 Thy 40 mg/kg組與 IRI組比較，腎小管擴(kuò)張，細(xì)胞腫脹，空泡變性，壞死，刷狀緣脫落，以及腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減少，其損傷評分為（1.5±0.5）分，這提示Thy組腎臟損傷明顯減輕（χ2=5.34，P=0.032）。結(jié)果顯示，Thy 40 mg/kg預(yù)處理能明顯減輕腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。見圖1。

2.3 Thy預(yù)處理抑制JAK2/STAT3/P53信號通路激活

與 Sham 組比較，IRI組 P-JAK2，P-STAT3，P53和 P21表達(dá)增高（χ2=4.74、4.79、5.18和 7.83，P=0.045、0.047、0.038和 0.007），但 JAK2和 STAT3表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.76和3.12，P=0.063和0.085）。與 IRI組比較，Thy 40 mg/kg 組 P-JAK2，P-STAT3，P53和 P21 表達(dá)降低（χ2=4.66、4.96、5.11和 8.87，P=0.044、0.039、0.27 和 0.006），而 JAK2 和STAT3表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.55和3.86，P=0.076和0.057）。這提示Thy 40 mg/kg預(yù)處理可以抑制JAK2/STAT3/P53信號通路激活。見圖2、表3。

表2 百里醌對C r和BU N的影響 （n=10，μmol/L，±s）

表2 百里醌對C r和BU N的影響 （n=10，μmol/L，±s）

注：1）與 Sham 組比較，P ＜0.05；2）與 IRI組比較，P ＜0.05

組別BUN Sham組 14.22±2.76 7.21±1.42 IRI組 145.35±7.571） 91.45±4.641）Thy 5 mg/kg組 85.75±7.532） 60.32±3.512）Thy 10 mg/kg組 62.74±5.772） 45.22±3.472）Thy 20 mg/kg組 30.65±3.782） 22.35±2.382）Thy 40 mg/kg組 31.23±4.552） 21.35±3.382）Cr

圖1 Thy預(yù)處理對腎組織病理結(jié)構(gòu)的影響 （PAS染色×400）

圖2 Thy 預(yù)處理對 P-JAK2、P-STAT3、JAK2、STATA3、P53和P21蛋白表達(dá)的影響

表3 Thy 對 P-JAK2、P-STAT3、JAK2、STATA3、P53 和P21蛋白表達(dá)的影響 （n=10，±s）

表3 Thy 對 P-JAK2、P-STAT3、JAK2、STATA3、P53 和P21蛋白表達(dá)的影響 （n=10，±s）

注：1）與 Sham組比較，P ＜0.05；2）與 IRI組比較，P ＜0.05

組別P-JAK2/JAK2P-STAT3/STAT3P53/β-actin P21/β-actin Sham 組 0.22±0.03 0.26±0.05 0.17±0.02 0.07±0.02 IRI組 1.41±0.121） 0.85±0.091） 0.76±0.041） 0.51±0.041）Thy組 0.55±0.072） 0.37±0.042） 0.44±0.032） 0.22±0.032）

2.4 Thy預(yù)處理可以減少促炎癥細(xì)胞因子TN F-α、I FN-γ和I L-8的表達(dá)

與Sham組比較，IRI組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ 和 IL-8 mRNA表達(dá)水平增高（χ2=4.58、4.76 和 4.91，P=0.045、0.043 和 0.041），而Thy 40 mg/kg組與IRI組比較，促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IFN-γ 和 IL-8 mRNA表達(dá)水平降低（χ2=4.66、4.74 和 5.03，P=0.044、0.042 和 P=0.038），見表4。

2.5 Thy預(yù)處理減少促炎癥細(xì)胞因子TN F-α、I FN-γ和I L-8的分泌

與Sham組比較，IRI組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ 和 IL-8分泌水平增高（χ2=5.73、4.82和5.04，P=0.028、0.043 和 0.039），而 Thy 40 mg/kg組與IRI組比較，促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-8分泌水平降低（χ2=5.23、5.82和 5.94，P=0.036、0.028 和 0.024），見表 5。

2.6 Thy預(yù)處理減少M D A表達(dá)

Sham 組 MDA 含量為（100±20）pg/ml，IRI組MDA 含量為（2 200±300）pg/ml，Thy組 MDA 含量為（600±150）pg/ml。與 Sham 組比較，IRI組 MDA 含量增高（χ2=15.82，P=0.001），而 Thy 40 mg/kg組與IRI組比較，MDA含量明顯降低（χ2=4.62，P=0.047）。

2.7 Thy預(yù)處理增加C AT、G Px和SO D的含量

與Sham組比較，IRI組CAT、GPx和SOD表達(dá)降低 （χ2=10.73、9.82 和 11.04，P=0.006、0.008 和0.004），而 Thy 40 mg/kg組與 IRI組比較，CAT、GPx和 SOD 的表達(dá)增高（χ2=4.99、5.82和 5.36，P=0.035、0.025 和 0.037），見表 6。

表4 Thy對TN F-α、I FN-γ和I L-8 mR N A表達(dá)水平的影響（n=10，±s）

表4 Thy對TN F-α、I FN-γ和I L-8 mR N A表達(dá)水平的影響（n=10，±s）

注：1）與 Sham 組比較，P ＜0.05；2）與 IRI組比較，P ＜0.05

組別IL-8 Sham組 0.95±0.10 IRI組 7.50±0.751）Thy 40 mg/kg 組 2.50±0.402）IFN-γ 1.00±0.10 1.00±0.05 12.00±1.501） 5.00±0.401）5.00±0.502） 1.50±0.502）TNF-α

表5 Thy對TN F-α，I FN-γ和I L-8分泌水平的影響（n=10，pg/ml，±s）

表5 Thy對TN F-α，I FN-γ和I L-8分泌水平的影響（n=10，pg/ml，±s）

注：1）與 Sham組比較，P ＜0.05；2）與 IRI組比較，P ＜0.05

組別IL-8 Sham組 100±20 IRI組 750±501）Thy 40 mg/kg 組 350±402）IFN-γ 100±10 120±20 1200±2001） 550±501）400±1502） 200±302）TNF-α

表6 Thy對C AT，G Px和SO D的表達(dá)影響（n=10，pg/ml，±s）

表6 Thy對C AT，G Px和SO D的表達(dá)影響（n=10，pg/ml，±s）

注：1）與 Sham組比較，P ＜0.05；2）與 IRI組比較，P ＜0.05

組別SO Sham組 117 IRI組 28±GPx 98±7 110±15 30±51） 32±41）2） 2）CAT D±9 51）Thy 40 mg/kg組 65±72）61±570±5

3 討論

目前，急性腎損傷乃至急性腎功能衰竭在臨床上的發(fā)生率很高，其預(yù)后也差。作為急性腎損傷常見原因的腎缺血再灌注損傷的治療，目前也越來越成為關(guān)注的熱點。既往研究表明，缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制包括鈣離子超載，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡和氧自由基增加[1-2]。腎臟缺血再灌注損傷可通過多條信號途徑如JAK2/STAT3，PI3K/AKT等對腎臟損傷進(jìn)行調(diào)節(jié)[3-4]。近來，P65信號蛋白也成為腎臟缺血再灌注損傷致病機(jī)制的研究熱點[10]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，Thy對腦，肝臟，腸道等器官缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，還可增加GPx，MDA以及IL-6等細(xì)胞因子水平，在一定程度上是通過抑制氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)誘發(fā)的損傷而下調(diào)器官損害用[6-9]。多種研究提示，Thy可與多種信號傳導(dǎo)分子相互影響，對MAPK、Ras、PI3K/AKT等多條胞內(nèi)信號途徑產(chǎn)生作用，調(diào)控機(jī)體功能[4-5]。

有研究顯示，JAK2/STAT3信號途徑的激活對細(xì)胞增殖、炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激乃至存活起著重要作用[11]。本實驗主要在活體大鼠研究Thy預(yù)處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用，并研究Thy對JAK2/STAT3-P65在腎臟再灌注損傷過程中的作用，結(jié)果顯示，Thy在一定程度上對JAK2及STAT3的激活具有抑制作用，以及可減小JAK2/STATA3的靶向分子P21的表達(dá)，表明Thy對JAK2/STAT3信號通路的激活具有抑制效應(yīng)。此外，P65蛋白是JAK2/STATA3信號通路的下游分子[11]，其對氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)都具有調(diào)控作用，可調(diào)節(jié)如MDA、SOD、IL-6、TNF-α以及趨化因子的表達(dá)[12]。但對腎臟P65信號蛋白的表達(dá)是否具有調(diào)節(jié)作用，目前尚不清楚。本實驗結(jié)果顯示，Thy預(yù)處理可明顯減少促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8和IFN-γ以及促氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA表達(dá)，但可加抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物CAT、GPx和SOD的表達(dá)，其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與抑制缺血誘發(fā)的JAK2/STAT3信號通路激活，從而抑制P65信號蛋白的活化，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而起到了腎臟保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本實驗證實，Thy能減少氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其作用機(jī)制可能是通過抑制JAK2/STAT3-P65信號通路，從而對腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。但是，在動物體內(nèi)，Thy調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路的具體機(jī)制極其復(fù)雜，對于腎臟損傷后JAK2/STAT3-P65信號通路的變化以及腎臟缺血再灌注損傷確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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（張蕾 編輯）

Influence of Thymoquinone pretreatment on renal ischemiareperfusion injury in rats

Xiao-hong Song,Cheng-xu Li,Yang Wu,Yuan Cai,Jun-wu Dong
(Department of Nephrology,Puai Hospital of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430034,China)

ObjectiveTo explore the influence of Thymoquinone(Thy)on kidney ischemia-reperfusion injury(IRI)and the mechanism.MethodsSixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation(sham)group,IRI group and IR plus different concentration of Thy preconditioning groups.Thy groups were preconditioned with Thy(5,10,20 and 40 mg/kg)by intraperitoneal injection at 45 min prior to operation,and the other 2 groups were pretreated by equal volume of saline.The rats in the IRI and Thy groups were kept in 37℃infant incubators for 45 min after their left renal pedicles were clamped with noninvasive endoclips,and then their right kidneys were removed.The rats in the sham group underwent the same process,except for clamping the left renal pedicles.After 24-h reperfusion,blood samples and renal tissues were collected.The pathological changes of kidney tissues were observed using PAS staining.The expression levels of serum creatinine(Cr),urea nitrogen(BUN),IL-8,IFN-γ,TNF-α,MDA,CAT,GPX and SOD were measured by ELISA.The expression of JAK2,STAT3,p-JAK2,p-STAT3,p53 and p21 were measured by Western blot.Moreover,the mRNA levels of IL-8,IFN-γ and TNF-αwere examined by RT-PCR.ResultsIRI markedly enhanced renal pathological changes and the expressions of BUN,Cr,p-JAK2,p-STAT3,p53,p21,MDA,IL-8,IFN-γ and TNF-α,meanwhile reduced the expressions of CAT,GPX and SOD.Thymoquinone pretreatment significantly decreased renal pathological changes and the expressions ofBUN,Cr,p-JAK2,p-STAT3,p53,p21,MDA,IL-8,IFN-γ and TNF-α,at the same time up-regulated the expressions of CAT,GPX and SOD.There was no significant difference in the expression of JAK2 or STAT3 among the three groups.ConclusionsThymoquinone pretreatment can alleviate kidney ischemia-reperfusion injury in rats partly by inhibiting inflammation and oxidative stress mediated by JAK2/STAT3/p53 signaling pathway.

Thymoquinone;renal ischemia-reperfusion injury;inflammation;oxidative stress;JAK2/STAT3/p53

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.004

1005-8982（2017）13-0019-05

2016-12-05