李曉川+周平+王朝海

摘要：利用BLASTp程序在馬鈴薯全基因組中共鑒定出54個潛在的馬鈴薯糖轉運子，分別屬于7個糖類轉運蛋白家族，分析這54個馬鈴薯糖轉運子基因在不同組織器官、發(fā)育階段、生物及非生物脅迫以及激素刺激下的表達水平與特性。該結果有助于加深對馬鈴薯糖轉運子的了解，可為發(fā)現(xiàn)能提高馬鈴薯經(jīng)濟性的新基因奠定基礎。

關鍵詞：馬鈴薯；糖轉運子；基因組；系統(tǒng)進化關系；表達分析

中圖分類號： S532.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0024-03

在植物中，碳水化合物被當作普遍的能量流通媒介，在整體水平上糖類的運輸被輸導組織所控制，因此有了同化及儲藏組織的概念[1]。典型的同化組織是光合作用活躍的組織，而儲藏組織如果實、塊莖等需要從同化組織轉運光合作用產(chǎn)物才能發(fā)育。在大多數(shù)植物種類中首選蔗糖作為在韌皮部篩管中長距離運輸?shù)奶妓衔颷2]。在細胞內(nèi)，糖類同樣在各細胞器之間運輸，而液泡則充當了許多種碳水化合物的儲藏器官[3]。從細胞膜或液泡膜轉運糖，無論是主動運輸還是被動擴散，都需要受到糖轉運子的介導才得以維持在一個較高的速率上。

盡管蔗糖轉運蛋白家族（sucrose transporter，SUC或SUT）在馬鈴薯中僅含有3個成員（在擬南芥中有9個成員），但是單糖的轉運蛋白在擬南芥中共有53個成員[4]，它們被劃分成7個基因家族[5]，目前通常認為這7個基因家族分別為糖轉運蛋白（sugar transporter protein，STP）家族、糖促進蛋白（sugar facilitator protein，SFP）家族、多元醇/單糖轉運蛋白（polyol/monosaccharide transporter，PMT）家族、肌醇轉運蛋白（inositol transporter，INT）家族、質(zhì)體葡萄糖轉運蛋白（plastidic glucose translocator，pGlcT）家族、液泡單糖轉運蛋白（tonoplast monosaccharide transporter，TMT）家族、液泡葡萄糖轉運蛋白（vacuolar glucose transporter，VGT）家族。盡管一些基因家族（如SUC、STP）有非常全面的基因功能分析數(shù)據(jù)（如轉運活力、表達水平、亞細胞定位以及轉基因分析），但是對許多小基因家族的成員表征分析的報道非常少，尤其是在一些非模式物種中。

馬鈴薯是全球第四大作物，同時也是糧菜兼用型作物，對馬鈴薯糖轉運子基因在全基因組水平上的調(diào)查有利于提高對它的理解，從而有助于鑒定提高馬鈴薯經(jīng)濟性的新基因。根據(jù)馬鈴薯參考基因組[6]確定54個編碼糖轉運子的基因座，使用系統(tǒng)進化分析的方法，將所有糖轉運子劃分到已知的家族內(nèi)，在每個家族內(nèi)，將馬鈴薯與其他植物的糖轉運子對比進化關系。利用RNA轉錄組的測序數(shù)據(jù)，分析糖轉運子基因在不同組織器官、發(fā)育階段、生物及非生物脅迫以及激素刺激下的表達水平。通過全面分析馬鈴薯糖轉運基因家族，為馬鈴薯糖轉運子的深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1馬鈴薯糖轉運子基因的鑒定

馬鈴薯潛在的糖轉運子，使用http：//www.solgenomics.net上的BLASTp工具，以每個家族中在擬南芥及番茄中已鑒定的成員的蛋白序列作為查詢序列，從馬鈴薯參考基因組[6]中鑒定出來。

1.2預測亞細胞定位及跨膜螺旋結構域

應用WoLF PSORT程序預測糖轉運子的亞細胞定位（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp）[7]。應用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜螺旋結構域[8]。

1.3糖轉運子RNA測序數(shù)據(jù)分析

利用馬鈴薯基因組測序協(xié)會（potato genome sequencing consortium，PGSC）的Illumina RNA測序數(shù)據(jù)分析糖轉運子的表達模式[7]。數(shù)據(jù)庫中的表達豐度用每百萬個映射上的片段數(shù)中映射到外顯子中的每1 000個堿基上的片段個數(shù)（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，F(xiàn)PKM）值表示。對組織器官及發(fā)育時期的熱圖（heat map）進行構建，F(xiàn)PKM值首先經(jīng)過以2為底數(shù)的對數(shù)進行轉化。對于非生物脅迫及生物脅迫以及激素處理的熱圖進行構建時，首先計算與相應的對照的對比值。熱圖使用MeV 4.9.0軟件進行構建[9]。

2結果與分析

2.1馬鈴薯糖轉運子成員及其同源蛋白的進化分析

應用已鑒定的糖轉運子的氨基酸序列，通過BLASTp程序檢索馬鈴薯參考基因組，鑒定出54個編碼全長糖轉運子的基因座，結果如圖1所示，通過進化分析將它們分成8個基因家族（蔗糖轉運家族、糖轉運子家族、糖促進蛋白家族、多元醇/單糖轉運蛋白家族、肌醇轉運蛋白家族、質(zhì)體葡萄糖轉運蛋白家族、液泡單糖轉運蛋白家族、液泡葡萄糖轉運蛋白家族）。同時，統(tǒng)計氨基酸數(shù)目并應用TMHMM Server v. 2.0預測跨膜結構域的數(shù)目，多數(shù)糖轉運子擁有8個以上的跨膜結構域以及400個以上的氨基酸。糖轉運子的亞細胞定位的預測結果顯示，多數(shù)糖轉運子定位在細胞膜及液泡膜上，此外，少數(shù)幾個糖轉運子預測定位在葉綠體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

在馬鈴薯中，3條氨基酸序列經(jīng)鑒定屬于蔗糖轉運家族。蛋白質(zhì)分別形成11個或12個跨膜蛋白結構域（TMD）。這與早期識別的3個馬鈴薯蔗糖轉運蛋白[10]一致，而且沒有發(fā)現(xiàn)更多的蔗糖轉運蛋白家族的成員。

糖轉運蛋白家族（STP）在水稻中也被稱為單糖轉運子家族（monosaccharide transporter，MST），在葡萄中被稱為己糖轉運子家族（hexose transporter，HT），是馬鈴薯中糖轉運子最大的家族，有20個成員（圖1），蛋白質(zhì)預測定位在細胞膜或液泡膜中。在馬鈴薯基因組中，10個氨基酸序列經(jīng)鑒定屬于糖促進蛋白家族（SFP），也被稱為類脫水初反應6家族（early response to dehydration 6-like，ERD 6-like），蛋白質(zhì)預測定位在細胞膜或液泡膜中。9個基因編碼多元醇/單糖轉運蛋白（PMT或PLT）（圖1），PMT的一般底物是糖醇如山梨糖醇或甘露糖醇，它在一些物種中取代蔗糖作為光合作用同化物的長距離運輸形式，最著名的是果樹薔薇科[11]。在馬鈴薯基因組中，鑒定出3個潛在的編碼H+/Na+MYO-肌醇轉運蛋白或肌醇轉運蛋白（INT或IRT）的基因座，預測含有10～12個跨膜結構域，含有496～578個氨基酸分子（圖1），INT被認為參與H+和肌醇的協(xié)同運輸。4個編碼質(zhì)體葡萄糖轉運蛋白（pGlcT）的基因座在馬鈴薯基因組中找到，預測形成9個或10個跨膜的結構域，蛋白在亞細胞水平預測定位在葉綠體（StpGlcT1和StpGlcT2）或細胞膜（StpGlcT3和StpGlcT4）中（圖1）。在馬鈴薯基因組中檢測到3種液泡單糖轉運蛋白（TMT），TMT在大多數(shù)物種中是氨基酸數(shù)量大于700的大蛋白，擁有10～11個跨膜結構域（圖1）。液泡葡萄糖轉運蛋白（VGT）是糖轉運子中成員最少的家族。在馬鈴薯基因組中鑒定出2個成員，分別是由503（StVGT1）、545（StVGT2）個氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，預測定位在細胞膜和葉綠體中（圖1）。endprint

2.2糖轉運子基因的表達

為確定糖轉運子的組織特異性以及發(fā)育時期表達，利用PGSC在馬鈴薯不同器官和發(fā)育階段以及在非生物脅迫處理、生物脅迫處理和激素刺激時的不同轉錄組經(jīng)mRNA測序所產(chǎn)生的轉錄組數(shù)據(jù)[6，12]，轉錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)過隨后的RNA定量分析驗證顯示出很高的準確性[12-13]。

PGSC的馬鈴薯RNA-seq提供了在16種組織中超過 22 000 個馬鈴薯基因表達的轉錄組數(shù)據(jù)，代表了主要器官和發(fā)育階段。54個糖轉運子基因，其中44個在16個不同的發(fā)育階段和器官檢測到的轉錄水平的數(shù)據(jù)，而其余10個糖轉運子基因可能由于翻譯水平太低而無法檢測到，或者因為具有空間和時間表達特性而不包括在這個RNA測序數(shù)據(jù)庫中。在這44個糖轉運子基因中有21個在所有的16種組織中都有表達，7個在1～5種組織中表達，4個在6～10種組織中表達，12個在11～15種組織中表達。一些糖轉運子基因表現(xiàn)出表達的組織特異性，如StSTP4、StSTP10、StSTP12、StPMT8、StINT3、StSFP7 均在花器官尤其是雄蕊中有表達。StSTP1、StSTP5在葉子和匍匐莖中表達量較高，StSTP1的同源蛋白（SlSTP1、AtSTP1、VvHT1）有己糖的運輸活性。與AtPMT1、AtPMT2序列相近的StPMT4，在所有16種組織中都有較高的表達，而AtPMT1、AtPMT2被證明參與轉運木糖醇和果糖[10]。StpGlcT1在成熟的果實中有高水平的表達，可能與它的同源蛋白一樣參與到成熟果實中通過分解淀粉而得到的葡萄糖的轉運。

利用在非生物脅迫處理及生物脅迫處理時得到的轉錄組數(shù)據(jù)，對糖轉運子基因進行表達譜分析。非生物脅迫處理（處理整株植物24 h）包括鹽（150 mmol/L NaCl）、甘露糖醇（260 mmol/L）、熱脅迫（35 ℃）等，參加分析的數(shù)據(jù)為計算每個處理相對于對照的相對表達豐度。在非生物脅迫處理下，30個糖轉運子基因在1個或1個以上脅迫條件下被誘導正表達，其中11個基因在所有的3種條件下在一定程度上均被正誘導，15個基因在2種條件下在一定程度上均被正誘導，4個基因在1種條件下在一定程度上均被正誘導。而StTMT家族在這3種條件下表達水平均沒有提升，而StSFP家族在鹽脅迫下有8個成員表達均有提高，StSFP6在熱脅迫下表達提高了10倍。StINT2在鹽和甘露糖醇脅迫下、StVGT2在鹽和熱脅迫下表達水平均有較大的提高。

生物脅迫處理包括接種馬鈴薯晚疫病菌和2種化學誘導因子[苯并噻二唑（BTH，100 mg/mL）、DL-氨基丁酸（BABA，2 mg/mL）]，以及利用離體受傷葉片模仿生物取食。參加分析的數(shù)據(jù)為計算每個處理相對于對照的相對表達豐度。在生物脅迫處理下，30個糖轉運子分子在1個或1個以上脅迫條件下被誘導正表達，其中2個基因（StVGT1和StTMT1）在所有的4種條件下在一定程度上都被正誘導；StVGT1和StTMT1在2種化學誘導因子下表達水平有較大提高。StSTP5、StPMT7、StpGlcT4、StVGT2等4個基因在受傷葉片上表達水平有較大的提高，其中StSTP5可能與參與生物脅迫時轉運碳水化合物的VvHT5為同源蛋白。

為了鑒定激素應激糖轉運子基因，利用激素刺激時得到的轉錄組數(shù)據(jù)分析整株植物經(jīng)IAA（吲哚乙酸）10 mmol/L、6-BA （6-芐基腺嘌呤）10 mmol/L、GA3（赤霉酸）50 mmol/L、ABA（脫落酸）50 mmol/L處理24 h后的相對表達豐度。在激素刺激下，22個糖轉運子基因在1個或1個以上脅迫條件下被誘導正表達，其中5個基因（StPMT2、StPMT6、StSFP1、StSFP2、StVGT2）發(fā)現(xiàn)在所有的4種條件下在一定程度上都被正誘導，StVGT2在6-BA處理后表達量提高11.8倍。

3結論

本研究在全基因組水平上全面分析了馬鈴薯糖轉運基因家族，根據(jù)馬鈴薯參考基因組確定54個編碼糖轉運子的基因，通過比較基因組學利用不同物種的同源糖轉運子了解馬鈴薯糖轉運子的功能，對比54個糖轉運子基因中的44個糖轉運子基因在16種主要器官和發(fā)育階段的組織中的表達情況，為下一步分析糖轉運子的具體功能提供理論基礎。

參考文獻：

[1]Bresinsky A，Krner C，Kadereit J W，et al. Strasburgers plant sciences：including prokaryotes and fungi[M]. Berlin：Springer，2013：531-568.

[2]Turgeon R，Wolf S. Phloem transport：cellular pathways and molecular trafficking[J]. Annual Review of Plant Biology，2009，60（1）：207-221.

[3]Shiratake K，Martinoia E. Transporters in fruit vacuoles[J]. Plant Biotechnology，2007，24（1）：127-133.

[4]Doidy J，Grace E，Kühn C，et al. Sugar transporters in plants and in their interactions with fungi[J]. Trends in Plant Science，2012，17（7）：413-422.

[5]Johnson D A，Hill J P，Thomas M A. The monosaccharide transporter gene family in land plants is ancient and shows differential subfamily expression and expansion across lineages[J]. BMC Evolutionary Biology，2006，6（1）：64.endprint

[6]Xun X，Pan S，Cheng S，et al. Genome sequence and analysis of tuber crop potato[J]. Nature，2011，475（7355）：189-195.

[7]Horton P，Park K J，Obayashi T，et al. WoLF PSORT：protein localization predictor[J]. Nucleic Acids Research，2007，35：585-587.

[8]Krogh A，Larsson B，Heijne G V，et al. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model：application to complete genomes[J]. Journal of Molecular Biology，2001，305（3）：567-580.

[9]Saeed A I，Sharov V，White J，et al. TM4：a free，open-source system for microarray data management and analysis[J]. Biotechniques，2003，34（2）：374-378.

[10]Charfeddine M，Sadi M N，Charfeddine S，et al. Genome-wide analysis and expression profiling of the ERF transcription factor family in potato（Solanum tuberosum L.）[J]. Molecular Biotechnology，2015，57（4）：348-358.

[11]Noiraud N，Maurousset L，Lemoine R. Transport of polyols in higher ]plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2001，39（9）：717-728.

[12]Massa A N，Childs K L，Lin H，et al. The transcriptome of the reference potato genome Solanum tuberosum Group Phureja clone DM1-3 516R44[J]. PLoS One，2011，6（10）：e26801.

[13]Singh A K，Sharma V，Pal A K，et al. Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato（Solanum tuberosum L.）[J]. DNA Research，2013，20（4）：403-423.馮紫洲，劉春梅，衡寶山，等.endprint