楊靜李慶剛徐國(guó)棟鄭小梅鄭平牟海津

（1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程科學(xué)院，青島 266003；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌構(gòu)建與發(fā)酵測(cè)試

楊靜1，3李慶剛2，3徐國(guó)棟2，3鄭小梅2，3鄭平2，3牟海津1

（1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程科學(xué)院，青島 266003；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

O-乙酰高絲氨酸（OAH）是具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的前體化合物，可用于制備高絲氨酸與蛋氨酸等。以一株改造自蘇氨酸產(chǎn)生菌的Escherichia coli ThrL為出發(fā)菌株，過(guò)表達(dá)OAH合成途徑中的關(guān)鍵酶高絲氨酸脫氫酶基因thrA和高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶基因metX，并利用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子組合優(yōu)化這兩個(gè)基因的表達(dá)水平，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蘇氨酸和酵母粉的濃度優(yōu)化以提升OAH的產(chǎn)生菌株的生產(chǎn)性能。通過(guò)啟動(dòng)子組合優(yōu)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)thrA與metX均采用J23110啟動(dòng)子時(shí)，該重組菌株E.coli OAH4的OAH合成能力最強(qiáng)，搖瓶發(fā)酵50 h后，其OAH產(chǎn)量為1.54 g/L。當(dāng)蘇氨酸的濃度為2 g/L，酵母粉的濃度為6 g/L時(shí)，E. coli OAH4的發(fā)酵水平最高，搖瓶發(fā)酵50 h后，OAH的產(chǎn)量可進(jìn)一步提升至1.98 g/L。本研究首次在E. coli中實(shí)現(xiàn)了OAH的合成，并通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化確定了OAH的最優(yōu)發(fā)酵條件，為后續(xù)OAH生產(chǎn)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

大腸桿菌；O-乙酰高絲氨酸；天冬氨酸激酶I/高絲氨酸脫氫酶I；高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶；發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

O-乙酰高絲氨酸（O-acetyl-homoserine，OAH）經(jīng)水解可以產(chǎn)生高絲氨酸，而高絲氨酸可以作為L(zhǎng)-高絲氨酸內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯、1，4-丁二醇等平臺(tái)化合物［1］以及農(nóng)藥草銨膦［2］合成的原料。另外，OAH可以與甲硫醇反應(yīng)生成蛋氨酸和乙酸［3，4］，是蛋氨酸合成的前體［5］。蛋氨酸廣泛用作動(dòng)物飼料［6，7］、食品［8］和醫(yī)藥［9］等多種領(lǐng)域，年需求量達(dá)160萬(wàn) t［10］。由此可見(jiàn)，OAH是一種具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的前體化合物。

大腸桿菌（Escherichia coli）作為一種化學(xué)品生產(chǎn)的模式菌株，具有代謝調(diào)控機(jī)制研究清晰［11］、遺傳操作簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn)，因此是OAH生產(chǎn)的合適出發(fā)菌株。但E. coli菌株并無(wú)OAH合成途徑，目前也尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。一些革蘭氏陽(yáng)性菌株，如谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中存在由metX基因編碼的高絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶（homoserine O-acetyltransferase，MetX），該酶能夠?qū)⒏呓z氨酸乙?；癁镺AH。如圖1所示，如在E. coli體內(nèi)中過(guò)表達(dá)該metX基因則可利用體內(nèi)存在的高絲氨酸為前體，實(shí)現(xiàn)OAH的合成。

L-高絲氨酸作為合成OAH的重要前體，是實(shí)現(xiàn)OAH體內(nèi)積累的關(guān)鍵。但高絲氨酸同時(shí)也是多種氨基酸合成的前體，因此，OAH生產(chǎn)菌株的構(gòu)建中，旁路氨基酸合成途徑的弱化與改造是必須的。如圖1所示，高絲氨酸參與蘇氨酸的合成，高絲氨酸上游前體物質(zhì)天冬氨酸經(jīng)過(guò)天冬氨酸激酶I/高絲氨酸脫氫酶I（Aspartokinase I/homoserine dehydrogenase I，ThrA）和天冬氨酸半醛脫氫酶（Aspartate-semialdehyde dehydrogenase，ASD）的作用被轉(zhuǎn)化為高絲氨酸，再經(jīng)過(guò)高絲氨酸激酶（Homoserine kinase，ThrB）和蘇氨酸合成酶（Threonine synthase，ThrC）的作用產(chǎn)生蘇氨酸。因此，蘇氨酸合成途徑中的thrB與thrC基因的弱化改造是關(guān)鍵。另外，高絲氨酸的前體天冬氨酸半醛同時(shí)是賴(lài)氨酸合成的前體，因此，從天冬氨酸半醛到賴(lài)氨酸的途徑弱化也是必要的。雖然高絲氨酸也可在高絲氨酸琥珀酰基轉(zhuǎn)移酶（Homoserine O-succinyltransferase，MetA）的作用下轉(zhuǎn)化為O-琥珀酰高絲氨酸（O-succinyl-homoserine，OSH），進(jìn)而合成蛋氨酸，但這與OAH到蛋氨酸合成的目標(biāo)一致，因此對(duì)蛋氨酸合成途徑無(wú)需改造。

由于OAH合成途徑的構(gòu)建中涉及較為復(fù)雜的途徑調(diào)控的問(wèn)題，因此選擇合適的出發(fā)菌株與各關(guān)鍵基因的協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)控較為重要。OAH可由L-高絲氨酸乙酰化而來(lái)，L-高絲氨酸是E. coli合成蘇氨酸的重要中間代謝物，因此蘇氨酸產(chǎn)生菌具有被改造用于生產(chǎn)OAH的潛力。由于蘇氨酸高產(chǎn)菌體內(nèi)蘇氨酸代謝途徑經(jīng)過(guò)優(yōu)化，賴(lài)氨酸途徑被弱化，減少了天冬氨酸半醛流向賴(lài)氨酸合成途徑，可以實(shí)現(xiàn)高絲氨酸前體天冬氨酸半醛的積累。通過(guò)弱化其體內(nèi)蘇氨酸合成途徑中的高絲氨酸下游代謝途徑，以及通過(guò)過(guò)表達(dá)thrA提高天冬氨酸半醛轉(zhuǎn)化為高絲氨酸的含量，可以進(jìn)一步提高胞內(nèi)高絲氨酸積累量。另一方面，由于OAH的前體物質(zhì)天冬氨酸半醛和高絲氨酸在胞內(nèi)的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制［12］，考慮到胞內(nèi)代謝平衡的問(wèn)題，因此對(duì)thrA和metX表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)控顯得很有必要。

針對(duì)上述旁路氨基酸合成途徑的改造問(wèn)題，本研究前期已將自主擁有的一株蘇氨酸產(chǎn)生菌E. coli ThrH［13］改造為出發(fā)菌株，利用E. coli ThrH自身基因組上的賴(lài)氨酸等其他氨基酸合成已弱化的特性，再通過(guò)將E. coli ThrH體內(nèi)含有的一個(gè)攜帶蘇氨酸代謝關(guān)鍵酶基因簇thrABC的質(zhì)粒丟失后，獲得無(wú)蘇氨酸積累的中間菌株E. coli ThrL。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究將以E. coli ThrL作為出發(fā)菌株，通過(guò)過(guò)表達(dá)thrA基因和metX基因來(lái)構(gòu)建OAH的產(chǎn)生菌株，并采用啟動(dòng)子組合對(duì)thrA基因和metX基因的協(xié)同表達(dá)水平進(jìn)行優(yōu)化，然后經(jīng)過(guò)發(fā)酵測(cè)試對(duì)一系列OAH產(chǎn)生菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行評(píng)價(jià)比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒信息以及引物、啟動(dòng)子序列 本研究所用的菌株、質(zhì)粒、引物與啟動(dòng)子信息見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑 PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；一步法無(wú)縫克隆試劑盒（ClonExpress? CE II）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司；限制性?xún)?nèi)切酶、PCR擴(kuò)增使用的phusion DNA polymerase購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；酵母粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；蘇氨酸購(gòu)自索萊寶生物公司；氨芐青霉素，2，4-二硝基氟苯購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

圖1 E. coli及C. glutamicum合成賴(lài)氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸途徑

1.1.3 儀器與設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems）；DNA凝膠電泳槽（Baygene）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma）；分光光度計(jì)及高效液相色譜儀（日本島津公司）；電擊轉(zhuǎn)化儀（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Nano drop（美國(guó)Thermo公司）；高通量振蕩培養(yǎng)箱（INFORS Multitron Pro）；24深孔板（常州英德生物有限公司）；葡萄糖檢測(cè)器所用SBA-40D生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院）。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基成分：胰化蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分［1，14］：葡萄糖 50 g/L，（NH4）2SO410 g/L，酵母粉（根據(jù)需要添加），蘇氨酸（根據(jù)需要添加），KH2PO42 g/L，3-（N-嗎啡啉）丙磺酸（MOPS）80 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·5H2O 0.1 g/L，MnSO4·5H2O 0.1 g/L。

1.2 方法

1.2.1 thrA和metX表達(dá)質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建 為了達(dá)到協(xié)同調(diào)節(jié)thrA和metX表達(dá)強(qiáng)度的目的，構(gòu)建不同啟動(dòng)子組合的thrA和metX協(xié)同表達(dá)質(zhì)粒，流程如圖2。以C. glutamicum 13032基因組為模板，使用引物metX110-F/R擴(kuò)增出帶有J23110啟動(dòng)子的metX片段（步驟①），命名為J23110-metX（其他片段命名規(guī)則與此相同）；使用pTrc99a-F/R擴(kuò)增出載體片段步驟②，使用一步法無(wú)縫克隆試劑盒將2條片段進(jìn)行同源重組，獲得質(zhì)粒pSYM-110（步驟③）。以質(zhì)粒pSYM-110為模板，分別使用引物J23101pTMX-F/R，J23100pTMX-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段使用BamH I酶切后自身連接，獲得質(zhì)粒pSYM-101（步驟④）和pSYM-100。分別以質(zhì)粒pSYM-110、pSYM-101和pSYM-100為模板，分別利用thrA114-F、thrA110-F、thrA101-F和thrA100-F為上游引物，利用ptmx-R為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)3種模板與4對(duì)引物的12種不同組合，獲得12種質(zhì)粒片段，其中啟動(dòng)子J23114分別與J23110-metX、J23101-metX組合的2條片段獲得過(guò)程如步驟⑤所示；以ThrH體內(nèi)攜帶的蘇氨酸代謝關(guān)鍵酶基因簇thrABC的質(zhì)粒為模板，使用引物thrA-F/R擴(kuò)增獲得不帶有啟動(dòng)子的thrA片段（步驟⑥）。利用一步法無(wú)縫克隆試劑盒，分別將這12條片段與不帶有啟動(dòng)子的thrA基因進(jìn)行同源重組，獲得表1中所示pSYM-1到pSYM-12共12種質(zhì)粒如步驟⑦。

經(jīng)過(guò)上述方法，將構(gòu)建的pSYM-1到pSYM-12共12種質(zhì)粒分別采用電轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化到ThrL中，獲得12株菌株，分別命名為：E. coli OAH1、E. coli OAH2、E. coli OAH3、E. coli OAH4、E. coli OAH5、E. coli OAH6、E. coli OAH7、E. coli OAH8、E. coli OAH9、E. coli OAH10、E. coli OAH11和E. coli OAH12。

1.2.2 菌株培養(yǎng) 常規(guī)的菌株培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，吸取5 μL甘油保存菌株接入到5 mL LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)作為種子液；測(cè)量OD600在4-5之間時(shí)，按1%接種量進(jìn)行接種。發(fā)酵培養(yǎng)使用24深孔板進(jìn)行，裝液量為500 μL，在高通量震蕩搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為800r/min，濕度為90%，培養(yǎng)時(shí)間為50 h。如菌株攜帶表1所示質(zhì)粒，則培養(yǎng)基中加入終濃度為100 mg/L的氨芐霉素。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒、引物和啟動(dòng)子

圖2 部分pSYM系列質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 菌株生長(zhǎng)必需氨基酸優(yōu)化 以不含蘇氨酸含酵母粉為3 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別測(cè)定1 g/L的蘇氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，每組3個(gè)平行。培養(yǎng)50 h后測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況（OD600）。

以不含蘇氨酸含酵母粉為3 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，測(cè)定菌株生長(zhǎng)所需的最適蘇氨酸濃度。蘇氨酸添加量分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 g/L，每組3個(gè)平行。培養(yǎng)結(jié)束后，檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況（OD600）。

1.2.3.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)OAH培養(yǎng)基優(yōu)化 首先以含蘇氨酸為2 g/L不含酵母粉的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，優(yōu)化酵母粉的濃度，添加量分別為1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7和8 g/L，每組3個(gè)平行。發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況（OD600）和上清液中OAH濃度。

其次以不含蘇氨酸不含酵母粉的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，組合優(yōu)化蘇氨酸和酵母粉的濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)OAH的影響，如表2所示，共16組不同的蘇氨酸和酵母粉濃度組合，每組3個(gè)平行。發(fā)酵50 h后，檢測(cè)上清液中OAH濃度以及計(jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)化為OAH的轉(zhuǎn)化率（OAH產(chǎn)量與葡萄糖消耗量的質(zhì)量百分比）。

表2 蘇氨酸與酵母粉協(xié)同優(yōu)化濃度組合

1.2.4 使用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中OAH濃度的方法及葡萄糖測(cè)定方法 取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL微量離心管中，12 000 r/min離心5 min；取10 μL上清，加入200 μL衍生緩沖液（0.5 mol/L 碳酸氫鈉溶液）、200 μL衍生劑（含量為1%的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液），迅速混勻并置于60℃水浴避光反應(yīng)1 h；衍生結(jié)束后，每個(gè)樣品體系中再加入390 μL定容緩沖液（50 mmol/L 磷酸二氫鉀溶于29.1 mmol/L NaOH溶液），定容至800 μL；利用0.22 μm濾膜過(guò)濾處理。HPLC檢測(cè)所用色譜柱為島津Inertsil?ODS分析色譜柱，柱溫箱保持36℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；流動(dòng)相A相為50 mmol/L 無(wú)水醋酸鈉，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.4；B相為50%乙腈溶液。流動(dòng)相總流量1 mL/min，采用梯度洗脫，A相比例分別為：0 min 16%、0.3 min 16%、4 min 30%、7 min 34%、12 min 43%、22 min 55%、25 min 55%、34 min 98%和35.5 min 16%。

葡萄糖分析方法：采用山東省科學(xué)院生產(chǎn)的SBA-40D生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 不同thrA和metX表達(dá)強(qiáng)度質(zhì)粒的構(gòu)建

為實(shí)現(xiàn)thrA和metX基因表達(dá)的組合調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)中利用不同表達(dá)強(qiáng)度的啟動(dòng)子J23114、J23110、J23101和J23100（J23110、J23101和J23100啟動(dòng)子強(qiáng)度分別約為J23114的3.3倍、7.0倍和9.9倍，http：//parts.igem.org/Part：BBa_J23100），對(duì)thrA和metX基因的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。構(gòu)建的12種組合中thrA基因和metX基因啟動(dòng)子的強(qiáng)度比例最高為3倍（J23100強(qiáng)度/J23110強(qiáng)度，pSYM-10），最低為0.1倍（J23114強(qiáng)度/J23100強(qiáng)度，pSYM-3）。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的J23110-metX片段，PCR結(jié)果（圖3-A）顯示，片段長(zhǎng)度為1 191 bp，目的條帶大小與預(yù)期正確；PCR擴(kuò)增獲得的thrA基因片段，PCR結(jié)果（圖3-B）顯示，片段長(zhǎng)度為1 819 bp，目的條帶大小與預(yù)期正確；帶有thrA基因的4種啟動(dòng)子J23114、J23110、J23101、J23100分別與J23110-metX、J23101-metX、J23100-metX組合的12條片段PCR結(jié)果（圖3-C）顯示，長(zhǎng)度為3 579 bp，目的條帶大小與預(yù)期正確。構(gòu)建獲得的12種質(zhì)粒分別利用引物testptmx-F和testptmx-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，理論上PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 120 bp，擴(kuò)增出的產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證大小正確（圖3-D），進(jìn)一步通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行了證實(shí)。最終獲得的12個(gè)啟動(dòng)子組合質(zhì)粒命名如表1中質(zhì)粒pSYM-1至pSYM-12所示。

圖3 pSYM系列質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中相關(guān)電泳驗(yàn)證結(jié)果

2.2 不同thrA和metX表達(dá)強(qiáng)度E.coli OAH的發(fā)酵測(cè)試

2.2.1 E.coli OAH菌株生長(zhǎng)所需氨基酸測(cè)試 利用E.coli OAH9菌株測(cè)試了蘇氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸對(duì)其生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)50 h后OD600，如圖4所示，不添加任何氨基酸的對(duì)照組的OD600為2.43，添加異亮氨酸和蛋氨酸組中，菌株E.coli OAH9的OD600分別為3.51和3.60，而添加蘇氨酸后菌株OD600顯著提高為11.93。

不同濃度的蘇氨酸對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，其結(jié)果如圖5所示。隨著蘇氨酸濃度從0 g/L到2 g/L逐漸升高，OD600也逐漸增加，蘇氨酸濃度為2 g/L時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)增加蘇氨酸濃度，反而OD600有下降趨勢(shì)。說(shuō)明2 g/L的蘇氨酸添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠滿(mǎn)足菌株的生長(zhǎng)需求。

圖4 菌株E. coli OAH9在含有不同氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)

圖5 菌株E. coli OAH9在含有不同濃度的蘇氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)

2.2.2 不同thrA和metX基因表達(dá)強(qiáng)度E. coli OAH的發(fā)酵測(cè)試 為了對(duì)12株不同thrA和metX基因表達(dá)強(qiáng)度的E. coli OAH菌株產(chǎn)OAH的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用含有3 g/L酵母粉和2 g/L蘇氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵50 h后，檢測(cè)發(fā)酵液OD600和OAH含量，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，E. coli OAH5的OD600最低（10.60），E. coli OAH4的OD600最高（18.07），可見(jiàn)thrA和metX基因的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)菌株的生長(zhǎng)具有明顯的影響。但是菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)OAH的能力卻不呈現(xiàn)正相關(guān)，如E. coli OAH9與E. coli OAH12的OD600分別為13.43和13.71，生長(zhǎng)水平相當(dāng)，兩者OAH的產(chǎn)量分別為0.66 g/L和0.19 g/L，前者OAH產(chǎn)量約為后者3.5倍?；旧?，當(dāng)thrA表達(dá)強(qiáng)度固定時(shí)，OAH的產(chǎn)量隨metX的表達(dá)增強(qiáng)呈下降趨勢(shì)。當(dāng)thrA基因的啟動(dòng)子為J23110，metX基因的啟動(dòng)子為J23110時(shí)，即菌株E. coli OAH4產(chǎn)OAH的能力最強(qiáng)，產(chǎn)量為1.54 g/L，是產(chǎn)量最低的菌株E. coli OAH12的5倍。

圖6 不同thrA和metX表達(dá)強(qiáng)度的E. coli OAH菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)OAH情況

2.3 菌株 E.coli OAH4的初步發(fā)酵優(yōu)化

2.3.1 酵母粉濃度優(yōu)化 為了考察酵母粉濃度對(duì)菌株合成OAH的影響，利用含有2 g/L蘇氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，檢測(cè)E. coli OAH4在不同酵母粉濃度條件下發(fā)酵產(chǎn)OAH的情況。分別檢測(cè)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的OAH含量和葡萄糖轉(zhuǎn)化為OAH的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖7所示。酵母粉濃度為1 g/L時(shí)菌株OD600為3.63，OAH產(chǎn)量為0.32 g/L，可見(jiàn)此時(shí)菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)。濃度處于2 g/L-5.5 g/L之間時(shí)，OAH產(chǎn)量處于1.2 g/L-1.4 g/L之間，轉(zhuǎn)化率處于2.49%-2.69%之間，OAH產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率基本沒(méi)有差別。酵母粉濃度增加到6 g/L時(shí)，OAH產(chǎn)量提高到1.92 g/L，轉(zhuǎn)化率提高到3.85%，隨著酵母粉濃度增加，OAH與轉(zhuǎn)化率并未提升，反而有不利影響。因此，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，蘇氨酸為2 g/L酵母粉的濃度為6 g/L時(shí)對(duì)于菌株E. coli OAH4產(chǎn)OAH最有利。

圖7 菌株E. coli OAH4在不同酵母粉濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及產(chǎn)OAH情況

2.3.2 蘇氨酸與酵母粉濃度協(xié)同優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 測(cè)試了不同的蘇氨酸和酵母粉濃度組合（表2）對(duì)E. coli OAH4發(fā)酵產(chǎn)OAH的影響，結(jié)果如圖8所示。在蘇氨酸濃度固定時(shí)，隨著酵母粉濃度的增加，OAH產(chǎn)量、OD600和轉(zhuǎn)化率基本呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。其中蘇氨酸2.5 g/L，酵母粉1 g/L時(shí)，OD600為3.07，此時(shí)菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)。另外，蘇氨酸濃度為1 g/L時(shí)，酵母粉從3 g/L增加至7 g/L時(shí)OAH產(chǎn)量、OD600及轉(zhuǎn)化率均無(wú)明顯變化，當(dāng)酵母粉濃度增加至9 g/L時(shí)三者才顯著增加。而蘇氨酸濃度為2 g/L時(shí)，OAH產(chǎn)量在1.41 g/L至1.98 g/L范圍類(lèi)，與其他組相比，該組酵母粉含量變化對(duì)OAH的產(chǎn)量變化影響更小，此時(shí)酵母粉為6 g/L時(shí)，OAH產(chǎn)量為1.98 g/L，轉(zhuǎn)化率為3.98%，均為最高水平。確定蘇氨酸為2 g/L，酵母粉為6 g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合方式。

圖8 菌株E. coli OAH4在不同蘇氨酸和酵母粉濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及產(chǎn)OAH情況

3 討論

本研究中thrA和metX基因的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)E. coli OAH系列菌株產(chǎn)OAH的水平起著重要影響。在出發(fā)菌株ThrL中過(guò)表達(dá)thrA，可以使菌株獲得生產(chǎn)高絲氨酸的能力，進(jìn)一步引入C. glutamicum來(lái)源的metX后，可以將高絲氨酸乙?；蒓AH。然而，高絲氨酸同時(shí)也是菌株生長(zhǎng)所需的多種氨基酸代謝途徑中的前體物質(zhì)［15-18］，在胞內(nèi)的含量水平會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)及OAH的生產(chǎn)造成影響；另外，由于ThrH的蘇氨酸代謝途徑得到過(guò)優(yōu)化，可以推測(cè)改造自ThrH的ThrL體內(nèi)代謝葡萄糖生成天冬氨酸半醛的速度較快，而中間物天冬氨酸半醛和高絲氨酸對(duì)菌株具有潛在的毒性［12］，大量積累對(duì)菌株生理造成影響?？紤]到以上兩點(diǎn)，調(diào)節(jié)thrA和metX的表達(dá)強(qiáng)度以改善菌株的代謝、生長(zhǎng)以及提高OAH的產(chǎn)量顯得很有必要，在此之前也沒(méi)有利用E. coli生產(chǎn)OAH的詳細(xì)報(bào)道，可以借鑒的經(jīng)驗(yàn)較少。因此，改造ThrL生產(chǎn)OAH也面臨很大挑戰(zhàn)。

在遺傳操作系統(tǒng)中，啟動(dòng)子是一個(gè)重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄元件，可以實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵酶的精確表達(dá)。已有研究證明，代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的過(guò)強(qiáng)表達(dá)會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制或由于代謝物的積累帶來(lái)的毒性作用［19，20］，相關(guān)研究采用了強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子對(duì)代謝途徑中多個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而對(duì)菌株的生長(zhǎng)及目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量起到了調(diào)節(jié)作用［21，22］。本研究通過(guò)啟動(dòng)子組合實(shí)現(xiàn)thrA和metX的表達(dá)調(diào)節(jié)，啟動(dòng)子本身的強(qiáng)度相差將近10倍，12種組合中thrA基因和metX基因啟動(dòng)子強(qiáng)度比例變化范圍為0.1-3之間，強(qiáng)度跨度較大，能夠?qū)AH的合成途徑進(jìn)行一定浮動(dòng)范圍內(nèi)的調(diào)控。對(duì)12種組合表達(dá)的菌株進(jìn)行發(fā)酵測(cè)試發(fā)現(xiàn)，菌株E. coli OAH4的OAH產(chǎn)量最高（1.54 g/L），是最低產(chǎn)量菌株的5倍，推測(cè)代謝過(guò)程中高絲氨酸積累程度和高絲氨酸乙?；潭仁怯绊懢晟L(zhǎng)和生產(chǎn)的重要因素，充分說(shuō)明了調(diào)節(jié)thrA和metX的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)于OAH的合成具有重要影響，合適的thrA和metX表達(dá)強(qiáng)度可以提高OAH的產(chǎn)量。

蘇氨酸是E. coli OAH系列菌株合成OAH的必需營(yíng)養(yǎng)因子。出發(fā)菌ThrL改造自蘇氨酸產(chǎn)生菌ThrH，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E. coli OAH系列菌株需要外源添加蘇氨酸以維持正常生長(zhǎng)，推測(cè)其基因組上蘇氨酸代謝途徑中thrB和thrC可能發(fā)生了一些復(fù)雜突變使其喪失了合成能夠維持自身生長(zhǎng)所需的蘇氨酸的能力。構(gòu)建產(chǎn)OAH的E. coli的改造重點(diǎn)是使高絲氨酸代謝生成OAH，在一定程度上也導(dǎo)致了高絲氨酸流向蘇氨酸的流量減少。由于OAH產(chǎn)生菌只是在ThrL的基礎(chǔ)上進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了thrA和metX的協(xié)同表達(dá)，沒(méi)有針對(duì)其生長(zhǎng)缺乏蘇氨酸的現(xiàn)象進(jìn)行相應(yīng)改造。因此，對(duì)E. coli OAH體內(nèi)的蘇氨酸代謝途徑進(jìn)行改造可能是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)，今后可以通過(guò)進(jìn)一步探索在E. coli OAH體內(nèi)重新過(guò)表達(dá)thrB和thrC，對(duì)其表達(dá)水平以及根據(jù)其對(duì)OAH代謝途徑的影響效果進(jìn)行不斷地調(diào)節(jié)，使其自身能夠合成滿(mǎn)足生長(zhǎng)所需的蘇氨酸。

酵母粉同樣是E. coli OAH系列菌株合成OAH的必需營(yíng)養(yǎng)因子。由于酵母粉含有氨基酸、肽類(lèi)、維生素、生長(zhǎng)因子及微量元素等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［23］，已有研究表明酵母粉與不同濃度的氨基酸混合添加到培養(yǎng)基中會(huì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物合成的代謝途徑產(chǎn)生復(fù)雜影響從而影響菌株生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)量［24］。針對(duì)本研究的OAH產(chǎn)生菌，考察了酵母粉和蘇氨酸濃度配比對(duì)菌株的生長(zhǎng)和OAH產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不含蘇氨酸，酵母粉3 g/L時(shí)，菌株E. coli OAH9無(wú)法生長(zhǎng)，可見(jiàn)酵母粉中營(yíng)養(yǎng)成分及其含有的蘇氨酸并不能完全滿(mǎn)足菌株生長(zhǎng)對(duì)蘇氨酸的需求。另外，蘇氨酸2.5 g/L，酵母粉1 g/L時(shí)菌株E. coli OAH4無(wú)法正常生長(zhǎng)，推測(cè)酵母粉中除蘇氨酸外的其他營(yíng)養(yǎng)成分可能對(duì)菌株的生長(zhǎng)具有重要作用。針對(duì)蘇氨酸2 g/L，酵母粉6 g/L時(shí)OAH產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率最高，確定了該組合為最優(yōu)配比方式。

對(duì)于利用微生物生產(chǎn)工業(yè)化學(xué)品來(lái)說(shuō)，產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率是兩個(gè)重要指標(biāo)［25］。因此，利用這兩個(gè)指標(biāo)對(duì)蘇氨酸和酵母粉添加量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。優(yōu)化后，菌株E. coli OAH4的產(chǎn)量從1.54 g/L提高到1.98 g/L，此時(shí)轉(zhuǎn)化率也最高（3.98%）。由于菌株代謝本身的復(fù)雜性，消耗葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí)，其葡萄糖有可能被菌體吸收則表現(xiàn)為OD600的增長(zhǎng)，有可能轉(zhuǎn)化為OAH則表現(xiàn)為OAH產(chǎn)量提高，也有可能產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物或被最終降解為CO2產(chǎn)生能量從而影響轉(zhuǎn)化率。因此，菌株的生長(zhǎng)、OAH產(chǎn)量以及OAH轉(zhuǎn)化率三者之間不一定完全關(guān)聯(lián)，本研究中OAH產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率之間并不總是正相關(guān)。因此，優(yōu)化培養(yǎng)基時(shí)需要綜合考慮產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率指標(biāo)。

4 結(jié)論

OAH是一種潛在的重要工業(yè)化學(xué)品，本文通過(guò)啟動(dòng)子組合優(yōu)化關(guān)鍵酶的基因thrA和metX在E. coli ThrL中的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了OAH的合成，并通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化進(jìn)一步提高了OAH的產(chǎn)量。本研究首次證明了在E. coli中合成OAH的可行性，并通過(guò)發(fā)酵測(cè)試確定了OAH的最優(yōu)發(fā)酵條件。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction and Fermentation Testing of an O-acetyl-homoserine Producing Escherichia coli Strain

YANG Jing1，3LI Qing-gang2，3XU Guo-dong2，3ZHENG Xiao-mei2，3ZHENG Ping2，3MOU Hai-jin1
（1. School of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

O-acetyl-homoserine（OAH）is an important industrial ingredient for homoserine and methionine production. We used the modified threonine-producing strain Escherichia coli ThrL as the host strain，to overexpress homoserine dehydrogenase gene thrA and homoserine acetyltransferase gene metX that are key genes for OAH production. The promoter combination was designed to optimize the transcription of these two key genes. Then，the concentrations of threonine and yeast extract in the fermentation medium were also optimized. After the promoter combination optimization，it showed that the OAH yield of the recombinant strain E.coli OAH4，in which the thrA and metX genes were separately controlled by J23110 promoter，was the highest and reached up to 1.54 g/L after 50 h incubation. When the concentrations of threonine and yeast extract were 2 g/L and 6 g/L，respectively，the OAH yield of E. coli OAH4 was the highest and further increased to 1.98 g/L after 50 h incubation. In this study，the synthesis of OAH was achieved in E. coli for the first time. The expression of thrA and metX，and fermentation conditions of OAH were optimized，which paved the way for the further OAH production research.

Escherichia coli；O-acetyl-homoserine；aspartate kinase I/homoserine dehydrogenase I；homoserine acetyltransferase；fermentation medium optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0310

2017-04-17

天津市高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)-微生物細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目（ZDRW-ZS-2016-2）

楊靜，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)；E-mail：yangjing1109love@163.com

鄭平，女，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)菌的代謝工程改造和系統(tǒng)生物學(xué)，E-mail：zheng_p@tib.cas.cn；牟海津，男，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：應(yīng)用微生物，E-mail：mousun@ouc.edu.cn