黃坤勇 李杉杉 郭強 毛培春 田小霞 孟林

（北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097）

黃花草木樨MoSOS1基因克隆及表達(dá)分析

黃坤勇 李杉杉 郭強 毛培春 田小霞 孟林

（北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097）

植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SOS1是植物耐鹽性必需的基因之一，在抵御鹽脅迫過程中發(fā)揮十分重要的作用。以黃花草木樨葉片總RNA為模板，通過RT-PCR結(jié)合RACE方法克隆得到黃花草木樨MoSOS1基因全長序列，命名為MoSOS1。序列分析表明該基因全長為3 931 bp，開放閱讀框（ORF）為2 874 bp，編碼957個氨基酸，分子量為112.8 kD，等電點為5.31。TMHAM軟件跨膜區(qū)的預(yù)測分析表明，黃花草木樨MoSOS1蛋白具有8個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，N端和C端都位于細(xì)胞外。氨基酸序列分析表明，MoSOS1蛋白含有1個Na+/H+Exchanger superfamily和一個cNMP（Cyclic nucleotide-monophosphate）結(jié)合位點以及1個CAP_ED（Catabolite gene activator protein-effector domain）superfamily結(jié)構(gòu)域。生物信息預(yù)測顯示，MoSOS1的編碼蛋白為不穩(wěn)定酸性蛋白，不存在信號肽，二級結(jié)構(gòu)多為α-螺旋和無規(guī)則卷曲。熒光實時定量RT-PCR分析表明：隨著NaCl濃度的增加，黃花草木樨地上部和根中MoSOS1基因表達(dá)水平呈增加趨勢，根中表達(dá)量大于地上部，表明MoSOS1基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。

黃花草木樨；MoSOS1基因；同源克隆；序列分析；基因表達(dá)

我國各類鹽堿地面積約0.99億hm2，鹽漬化土壤面積約0.369億 hm2，殘余鹽漬化土壤面積約0.448億 hm2，潛在鹽漬土化土壤為0.173億hm2［1］。利用鹽生植物改良修復(fù)鹽堿土具有投資少，見效快的特點［2］。但鹽堿脅迫能造成植物體離子失衡和滲透脅迫，研究植物耐鹽機制，篩選和培育抗鹽植物品種，提高植物本身的耐鹽能力，是改良和開發(fā)利用鹽堿地經(jīng)濟(jì)而有效的方法［3］。土壤中過高濃度的Na+會造成植物的生理干旱，擾亂細(xì)胞的離子平衡，導(dǎo)致膜功能失調(diào)和代謝活動的減弱，從而抑制生長并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［4］。植物細(xì)胞抵御Na+毒害的主要策略有Na+外排和Na+區(qū)域化［5］，其中Na+外排過程中，質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白依靠質(zhì)膜H+-ATPase形成的H+跨膜電化學(xué)勢梯度為其提供驅(qū)動力，將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na+外排，從而減輕了Na+對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的各類代謝酶的傷害［6］［7］。

SOS（Salt overly sensitive）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是植物耐鹽性相關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。目前，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［6］、互花米草（Spartina alterniflora）［8］、胡楊（Populus euphratica）［9］、海濱錦葵（Kosteletzkya virginica）［10］、獐茅（Aeluropus littoralis）［11］、大葉補血草（Limonium gmelinii）［12］、甘蔗（Saccharum hybrid）［13］等植物上已成功克隆到SOS1基因，并進(jìn)行了耐鹽功能分析。在擬南芥中，AtSOS1基因編碼一個質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，C-末端為一長親水性尾鏈，位于胞質(zhì)中，作為感受器感知胞質(zhì)中Na+濃度變化，引發(fā)胞質(zhì)Ca2+信號的產(chǎn)生，隨后Ca2+信號刺激SOS3-SOS2復(fù)合物激活SOS1，將Na+排出胞外，從而提高植物的耐鹽性［14-16］。擬南芥SOS1突變體對鹽非常敏感，過表達(dá)SOS1基因能提高其耐鹽性，鹽脅迫下積累更少的Na+［17］，表明SOS1基因在擬南芥耐鹽性中發(fā)揮著重要作用。Yue等［18］在煙草（Nicotiana tabacum）中過表達(dá)擬南芥SOS1基因發(fā)現(xiàn)可提高耐鹽性，且轉(zhuǎn)基因植株保持較高的K+/Na+。權(quán)庚等［8］研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)互花米草SaSOS1基因的水稻（Oryza sativa）對鹽脅迫具有較強的適應(yīng)性，表明轉(zhuǎn)SaSOS1基因能提高水稻耐鹽性。Wu等［9］在胡楊中通過設(shè)計簡并引物RACE技術(shù)克隆得到PeSOS1基因，PeSOS1在葉片中的表達(dá)明顯受高鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）誘導(dǎo)，并定位在細(xì)胞膜。但國內(nèi)外尚未見黃花草木樨（Melilotus officinalis（L.）Lam.）MoSOS1基因的克隆和表達(dá)模式分析的報道。黃花草木樨為豆科草本植物具有抗旱、耐寒、耐鹽堿、耐土壤貧瘠等的特性［19］，適應(yīng)性較廣，防風(fēng)擋沙，保持水土［20，21］，還是一種優(yōu)良牧草和優(yōu)質(zhì)綠肥［22，23］。本實驗采用RT-PCR及RACE方法克隆黃花草木樨MoSOS1基因，并分析其結(jié)構(gòu)特征與表達(dá)模式，為深入研究MoSOS1的功能特征奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 黃花草木樨種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 主要試劑 TaKaRa MiniBEST Plant RNA 提取試劑盒、Prime Script RTase第一鏈cDNA合成試劑盒、克隆載體pMD19-TVector、DNA marker、TaKaRa LA Taq 試劑盒、大腸桿菌菌株Escherichia coli DH5α等購自大連寶生物工程有限公司，其它生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實驗材料培養(yǎng) 用5% NaClO溶液將草木樨種子消毒 5 min 后，于培養(yǎng)皿中發(fā)芽。待幼苗種子萌發(fā)后移至水培盒上，于1×Hoagland營養(yǎng)液中生長，間隔7 d更換一次Hoagland 營養(yǎng)液，光照周期為白天16 h/夜晚8 h，晝夜溫度分別為25℃和18℃，光照強度為600 μmol·m-2·s-1空氣相對濕度為60%左右。在人工氣候箱中培育至6 周齡后進(jìn)行200 mmol/L NaCl鹽脅迫處理。

1.1.4 引物設(shè)計和合成 使用Primer 5.0 軟件設(shè)計核心引物，DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行3'及5'RACE引物設(shè)計、序列拼接和分析測序得到的基因序列，引物由上海生工合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 黃花草木樨MoSOS1基因的克隆 取6周齡的黃花草木樨幼苗，用200 mmol/L NaCl溶液脅迫48 h，誘導(dǎo)相關(guān)耐鹽基因的表達(dá)，采集植物鮮葉，經(jīng)無菌水沖洗數(shù)次至無鹽分殘留，消毒濾紙吸干植物葉片表面水分，稱取100 mg 裝于1.5 mL RNasefree管中，用寶生物 MiniBEST RNA植物RNA提取試劑盒提取植物總RNA，利用PrimeScriptTM RTase第一鏈cDNA試劑盒合成cDNA（大連TaKaRa公司）。

表1 引物序列

MoSOS1完整編碼區(qū)的cDNA擴(kuò)增，先比較Gen Bank數(shù)據(jù)庫中擬南芥SOS1基因序列（NM_126259.4）、大豆SOS1基因（NM_001258010.1）及綠豆SOS1基因序列（KC855193.1）同源保守序列，根據(jù)保守同源序列設(shè)計簡并引物：MoSOS1-F1/MoSOS1-R1。PCR擴(kuò)增出MoSOS1的保守核心片段。擴(kuò)增的保守核心片段cDNA插入到pMD19-T載體（大連TaKaRA公司），由北京擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。MoSOS1完整編碼區(qū)cDNA的獲得采用cDNA末端快速擴(kuò)增法（Rapid amplification of cDNA ends，RACE），PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段，通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并用 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver 4.0純化試劑盒純化回收 DNA 目的片段，將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T 載體上后轉(zhuǎn)化克隆并進(jìn)行陽性菌株鑒定，由北京擎科生物技術(shù)公司測序。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR 采用實時熒光定量PCR方法，分析不同鹽濃度（0、50、100和200 mmol/L NaCl）處理48 h后黃花草木樨地上部和根中MoSOS1基因的表達(dá)模式。鹽處理下黃花草木樨地上部和根中的總RNA提取參照寶生物TaKaRa MiniBEST Plant RNA 試劑盒說明書進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行（寶生物工程有限公司）。黃花草木樨MoSOS1基因?qū)崟r熒光定量RTPCR引物SOS1F/SOS1R，PCR產(chǎn)物長度為168 bp，其內(nèi)參基因Actin實時熒光定量PCR引物ActinF2/ ActinR2，PCR產(chǎn)物長度為80 bp。

參照考寶生物SYBR? Premix Ex Taq II試劑盒說明書的方法，在Step One Plus儀器上進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，SYBR? Premix Ex Taq II 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，正、反向引物分別為1 μL，加水補至20 μL，40個循環(huán)。采用2-△△CT方法計算黃花草木樨基因MoSOS1在不同鹽濃度脅迫下的相對表達(dá)量，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析方法如下。利用 ORF finder在線軟件，對黃花草木樨MoSOS1基因進(jìn)行開放閱讀框分析并翻譯；利用ExPASy中ProtParam pI/Mw（http://web.expasy.org/protparam/）在線工具對黃花草木樨MoSOS1 基因所編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用PRABI（https://npsa-prabi.ibcp. fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl）進(jìn)行黃花草木樨MoSOS1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用SignalP 4.1 Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/Signal P/）進(jìn)行黃花草木樨MoSOS1蛋白信號肽分析；用NCBI 上Blast 工具進(jìn)行同源氨基酸序列查找，并利用DNAMAN 對所獲得同源氨基酸序列以及鷹嘴豆SOS1、大豆SOS1 等蛋白序列進(jìn)行序列比對，最后在MEGA6.0 中采用NJ（Neighbor-Joining）法（Boot Strap 1000）構(gòu)建進(jìn)化樹。氨基酸序列跨膜預(yù)測在TMHMM（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）網(wǎng)站上進(jìn)行。利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行MoSOS1保守區(qū)段預(yù)測。

圖1 MoSOS1核心區(qū)基因（A）、3' RACE（B）及5' RACE（C）PCR擴(kuò)增

2 結(jié)果

2.1 黃花草木樨MoSOS1基因的克隆

根據(jù)大豆（Glycine max）、綠豆（Vigna radiat）、擬南芥SOS1蛋白基因保守同源序列設(shè)計簡并引物（MoSOS1-F1、MoSOS1-R1），以黃花草木樨葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出黃花草木樨MoSOS1保守核心cDNA片段，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)核心片段為369 bp（圖1-A）。用MoSOS1保守核心片段的已知序列，設(shè)計引物進(jìn)行3'RACE和5'RACE。3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序為3 074 bp（圖1-B），5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序為751 bp（圖1-C）。經(jīng)DNAMAN軟件序列拼接得到黃花草木樨MoSOS1的全長cDNA序列，長度為3 931 bp（圖2）。根據(jù)MoSOS1拼接序列設(shè)計MoSOS1閱讀框引物（MoSOS1-ORF-F1、MoSOS1-ORF-R1），PCR擴(kuò)增出一條約3 000 bp的特異目的條帶（圖3），經(jīng)克隆測序得到了黃花草木樨MoSOS1的開放閱讀框（ORF）序列2 874 bp，可編碼957個氨基酸，推測等電點為5.31，分子量為112.8 kD。

2.2 黃花草木樨MoSOS1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 黃花草木樨MoSOS1基因編碼氨基酸的一級和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 通過在線工具ExPASy中ProtParam pI/Mw，預(yù)測黃花草木樨MoSOS1基因編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白分子量為112.8 kD，包含957個氨基酸殘基。MoSOS1 蛋白等電點（pI）為5.31，有負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）102個，正電荷殘基（Arg+Lys）88個，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定系數(shù)（II）為45.32，平均疏水性（GRAVY）-0.000，脂肪系數(shù)（AI）98.91。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)大40，蛋白質(zhì)表現(xiàn)為不穩(wěn)定狀態(tài)。因此，推測黃花草木樨MoSOS1基因編碼的蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。

MoSOS1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測在SOPMA在線（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl）預(yù)測，MoSOS1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)交錯構(gòu)成，其中含α-螺旋43.68%，延伸鏈12.96%，無規(guī)卷曲43.36%（圖4）。

2.2.2 黃花草木樨MoSOS1蛋白信號肽預(yù)測和分析 根據(jù)SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測可知，第20位谷氨酸殘基具有較高的原始剪切分值0.509和最高的綜合剪切位點分值0.298，第1位甲硫氨酸殘基具有最高的信號肽分值0.279。由于最后獲得氨基酸殘基的加權(quán)平均值較小，為0.253，推測MoSOS1基因所編碼的蛋白不存在信號肽，即為非分泌型蛋白，說明該蛋白在細(xì)胞質(zhì)合成后不能被轉(zhuǎn)運（表2）。

2.2.3 黃花草木樨MoSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測及跨膜結(jié)構(gòu)分析 NCBI保守結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，黃花草木樨MoSOS1蛋白包含Na+/H+Exchanger superfamily和一個cNMP（Cyclic nucleotide-monophosphate）結(jié)合位點及一個CAP_ED（Catabolite gene activator protein-effector domain）superfamily（圖5-A）。運用在線分析軟件TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu. dk/service/TMHMM/）分析目的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；發(fā)現(xiàn)MoSOS1含有8個跨膜區(qū)域，N、C端位于細(xì)胞外。多重序列比較表明，MoSOS1跨膜區(qū)氨基酸序列位置分別為5-27，34-56，61-78，85-104，119-141，153-175，190-208，228-250（圖5-B）。

圖2 MoSOS1全長基因序列及其推導(dǎo)的編碼氨基酸序列

圖3 MoSOS1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 MoSOS1二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.4 黃花草木樨MoSOS1蛋白的氨基酸序列多重比較分析 將推測的MoSOS1氨基酸序列與其它植物SOS1的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，它與鷹嘴豆（Cicer arietinum）、大豆（Glycine max）、綠豆（Vigna radiat）的同源性分別達(dá)到89%、84%和68%（圖6）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，黃花草木樨MoSOS1與鷹嘴豆和大豆親緣關(guān)系最近，而與山萮菜（Eutrema salsugineum）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖7）。由此表明MoSOS1是一類Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，與鷹嘴豆、大豆等的質(zhì)膜SOS1具有相同功能。

2.3 黃花草木樨MoSOS1基因鹽脅迫下表達(dá)分析

通過實時熒光定量PCR檢測6周齡黃花草木樨幼苗鹽脅迫48 h后MoSOS1基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)MoSOS1基因在根和地上部均有表達(dá)，且表達(dá)量隨著鹽脅迫濃度的增加而有增加趨勢。在100、150及200 mmol/L NaCl脅迫下，MoSOS1基因表達(dá)量要顯著高于對照（P<0.05），且根部MoSOS1表達(dá)水平分別為地上部1.8、1.3和1.5倍（圖8）。由此表明MoSOS1的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，且具有根部表達(dá)的特異性。

表2 黃花草木樨MoSOS1蛋白信號肽預(yù)測

3 討論

圖5 黃花草木樨MoSOS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)（A）及跨膜結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測

本文以RT-PCR及RACE方法，成功克隆到黃花草木樨SOS1轉(zhuǎn)運蛋白基因的cDNA，其編碼957個氨基酸，同源比對結(jié)果顯示MoSOS1蛋白與鷹嘴豆Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的同源性最高，達(dá)89%，與大豆SOS1和綠豆SOS1的同源性分別達(dá)84%和68%，說明SOS1蛋白在不同物種間具有較高的保守性。擬南芥SOS1蛋白C末端是調(diào)節(jié)活性的區(qū)域，高度親水，其結(jié)構(gòu)含有多個蛋白激酶作用位點，參與鈣調(diào)素的結(jié)合以及多種信號的啟動反應(yīng)［24］。賈圓圓等［25］研究發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳（Tamarix hispida）ThSOS1蛋白C端具有一個較長的親水性尾巴，能夠使SOS1與逆境相關(guān)調(diào)控因子發(fā)生互作，從而適應(yīng)鹽漬環(huán)境。本實驗也發(fā)現(xiàn)黃花草木樨MoSOS1蛋白C末端含有一個長的親水性尾巴，推測其能夠與逆境相關(guān)調(diào)控因子發(fā)生互作，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的Na+含量。

Shi等［6］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥SOS1蛋白跨膜區(qū)與細(xì)菌、真菌質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白相似性極高，SOS1突變體對鹽脅迫敏感，系統(tǒng)發(fā)育分析表明SOS1是一類質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。Shi等［17］經(jīng)過酵母功能互補試驗及SOS1-GFP定位證明擬南芥SOS1是質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。王澍等［26］成功克隆到黃瓜（Cucumis sativus）SOS1基因全長cDNA，亞細(xì)胞定位表明該蛋白存在于細(xì)胞膜上，酵母功能互補試驗顯示CsSOS1參與Na+/H+的轉(zhuǎn)運。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示MoSOS1氨基酸序列與高等植物中已知序列質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（SOS1）的同源性較高，表明黃花草木樨MoSOS1是一類質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。

圖6 黃花草木樨MoSOS1蛋白與其它植物蛋白的氨基酸序列多重比對

圖7 不同物種SOS1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖8 不同濃度NaCl處理下黃花草木樨地上部和根中MoSOS1基因的表達(dá)分析

劉峰等［13］分析甘蔗SOS1蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)該蛋白無規(guī)則卷曲所占比例最高，為51.3%，其次是α-螺旋占32.86%，延伸鏈占15.84%，β-螺旋為0。郭慶水等［27］分析木欖（Bruguiera gymnorrhiza）質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其α-螺旋占50.13%，無規(guī)則卷曲所占30.70%，延伸鏈占13.96%，β-螺旋為5.2%。本實驗分析表明黃花草木樨MoSOS1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與甘蔗SOS1及木欖SOS1蛋白類似，主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)交錯構(gòu)成，其中含α-螺旋43.68%，無規(guī)卷曲43.36%，延伸鏈12.96%，β-螺旋為0%。此外，劉峰等［13］分析甘蔗ScSOS1蛋白包含CAP_ED（catabolite gene activator protein-effector domain）superfamily 和一個Crp domain（cAMP-receptor proteins），含有一個 ligand 結(jié)合位點和一個cNMP（Cyclic nucleotidemonophosphate）結(jié)合位點。王艷紅等［10］分析海濱錦葵耐鹽基因KvSOS1蛋白發(fā)現(xiàn)其 N-末端具有NhaP、Na+/H+Exchanger、b_cpa1 等保守結(jié)構(gòu)域，C -末端有cNMP、Crp 等保守結(jié)構(gòu)域，表明該基因?qū)儆贜a+/H+轉(zhuǎn)運蛋白家族成員。NCBI保守結(jié)構(gòu)預(yù)測表明MoSOS1蛋白包含Na+/H+Exchanger superfamily，一個cNMP（Cyclic nucleotide- monophosphate）結(jié)合位點以及一個CAP_ED（Catabolite gene activator protein-effector domain）superfamily，說明MoSOS1與甘蔗ScSOS1和海濱錦葵KvSOS1蛋白具有相似結(jié)構(gòu)，屬于Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，參與細(xì)胞內(nèi)Na+的調(diào)控轉(zhuǎn)運。

程玉祥［28］研究星星草（Puccinellia tenuiflora）質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白（SOS1）基因的克隆，半定量RT-PCR分析表明PtSOS1基因表達(dá)明顯受鹽脅迫上調(diào)。鄭琳琳等［29］研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫能誘導(dǎo)唐古特白刺（Nitraria tangutorum）質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白NtSOS1基因的表達(dá)。本實驗發(fā)現(xiàn)黃花草木樨幼苗鹽脅迫48 h后，MoSOS1基因在根和地上部均有表達(dá)，且表達(dá)量隨著鹽脅迫濃度的增加而有增加趨勢，表明鹽脅迫能上調(diào)MoSOS1基因的表達(dá)。Raquel等［30］研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯（Solanum tuberosum）SOS1蛋白不僅具有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運功能，而且能調(diào)節(jié)植物不同器官間Na+分布。Yang等［31］在擬南芥中過表達(dá)AtSOS1基因，轉(zhuǎn)基因植株能耐受200mmol/L的NaCl處理，且轉(zhuǎn)基因植物木質(zhì)部的Na+含量要明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株，說明SOS1蛋白在長距離的Na+運輸中發(fā)揮作用。Shi等［17］在擬南芥中過表達(dá)AtSOS1基因，轉(zhuǎn)基因植株上調(diào)SOS1基因的表達(dá)，且鹽處理下，過表達(dá)SOS1基因植株在木質(zhì)部蒸騰流及地上部積累更少的Na+，且轉(zhuǎn)基因植株提高耐鹽性是通過限制Na+在細(xì)胞內(nèi)積累，從木質(zhì)部吸收Na+，從而降低地上部Na+含量。Guo等［32］研究鹽脅迫下野生型擬南芥和SOS突變體SOS1活性，通過幼苗成像分析和電生理的研究，表明SOS1具有在根部分生組織和莖維管束薄壁細(xì)胞表達(dá)的特異性，SOS1參與鹽脅迫下Na+外排作用。本實驗發(fā)現(xiàn)MoSOS1具有根部表達(dá)的特異性，根部MoSOS1表達(dá)水平高于地上部。這可能是由于根部分生組織沒有液泡，鹽脅迫下不能進(jìn)行Na+區(qū)隔化［33］，根部組織只有通過上調(diào)MoSOS1基因的表達(dá)，將進(jìn)入根系的Na+及時排除體外，從而維持植株根系較低的Na+含量；另一方面，有利于將木質(zhì)部蒸騰流中的Na+及時吸收以減少地上部Na+含量，從而維持植株地上部較低的Na+含量。

4 結(jié)論

黃花草木樨具有較強的抗旱耐鹽性。本實驗從黃花草木樨中成功克隆到MoSOS1基因，ORF 2 874 bp，編碼957個氨基酸。MoSOS1蛋白與鷹嘴豆Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的同源性高達(dá)89%，與大豆SOS1和綠豆SOS1的同源性分別達(dá)84%和68%。實驗結(jié)果還表明在NaCl脅迫下，MoSOS1基因表達(dá)具有組織特異性，根中表達(dá)量大于地上部，在黃花草木樨耐鹽分子機制中發(fā)揮作用。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of MoSOS1 Gene in Melilotus officinalis

HUANG Kun-yong LI Shan-shan GUO Qiang MAO Pei-chun TIAN Xiao-xia MENG Lin
（Beijing Research and Development Center for Grass and Environment，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097）

Plant salt overly sensitive 1（SOS1）gene，encoding a Na+/H+anti-port protein，plays an important role in biological processes of plants against salt stress. Using the total RNA extracted from the young leaves of Melilotus officinalis（L.）Lam. as the template，the full-length sequence of SOS1 gene was amplified by the reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）method and rapid amplification of cDNA ends（RACE），named MoSOS1. The bioinformatics analysis showed that MoSOS1 was in a length of 3931 bp with a complete open reading frame（ORF 2 874 bp），encoding a 957 amino acid residues of MoSOS1 protein with an estimated molecular weight of 112.8 kD and a calculated isoelectric point（pI）of 5.31. The prediction of transmembrane region of MoSOS1 by TMHAM software indicated that MoSOS1 had 8 transmembrane regions and N-terminal and C-terminal were located outside the cell. Amino acid alignment analysis demonstrated that the protein of MoSOS1 contained a conserved Na+/H+exchanger superfamily，a cNMP（Cyclic nucleotide-monophosphate）and a CAP_ED（Catabolite gene activator protein-effector domain）superfamily. The bioinformatics analysis showed that MoSOS1 protein belonged to unstable acidic protein with mainly secondary structure of α spiral and random coil，and in which there was no signal peptide. Quantitative real-time RT-PCR analysis showed that expression levels of MoSOS1 presented an increase trend in both shoots and roots with the increase of external NaCl concentrations，and its levels in roots were higher than those in shoots，indicating that the expression of MoSOS1 was induced and regulated by salt.

Melilotus officinalis（L.）Lam.；MoSOS1 gene；homo-cloning；sequence analysis；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0364

2017-05-06

國家國際科技合作專項（2015DFR30570），北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（KJCX20170110）

黃坤勇，男，碩士研究生，研究方向：草種質(zhì)資源評價；E-mail：huangkunyonk@163.com

孟林，男，漢，博士，研究員，研究方向：草資源遺傳育種與林草復(fù)合研究；E-mail：menglin9599@sina.com