王偉杰，榮詩闊，王金凱，李 海

·論 著·

雙歧桿菌完整肽聚糖對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株增殖能力及VEGF、Ki67表達(dá)的影響

王偉杰1，榮詩闊2，王金凱2，李 海1

目的探討雙歧桿菌完整肽聚糖(WPG)對結(jié)腸癌SW480(原位結(jié)腸癌細(xì)胞)細(xì)胞株增殖能力及VEGF、Ki67表達(dá)的影響。方法常規(guī)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株培養(yǎng)后，給予不同濃度的WPG(20、40、80、160、320 μg/mL)共孵育一定時(shí)間(24 h、48 h和72 h)后，計(jì)算不同濃度WPG對SW480細(xì)胞株的抑制率；CCK-8法檢測干預(yù)后細(xì)胞的增殖能力，Western blot(免疫印跡法)檢測干預(yù)后VEGF、Ki67的表達(dá)水平變化。結(jié)果CCK-8(Cell Counting Kit-8)法顯示不同濃度干預(yù)SW480細(xì)胞株的抑制率不同，具有濃度依耐性，并顯示干預(yù)后細(xì)胞株增殖能力降低；Western-blot顯示干預(yù)后SW480細(xì)胞株中VEGF(P<0.05)、Ki67(P<0.05) 較對照組蛋白表達(dá)水平下降。結(jié)論雙歧桿菌完整肽聚糖能抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株的增殖能力，并能下調(diào)VEGF、Ki67表達(dá)水平，從而抑制腫瘤的發(fā)展。

雙歧桿菌完整肽聚糖；結(jié)直腸癌；增殖；VEGF；Ki67

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在男性惡性腫瘤中排第三位、女性惡性腫瘤中排第二位[1]，在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量水平[2]。腸道的微生態(tài)系統(tǒng)是機(jī)體最重要也是最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，對宿主的健康與營養(yǎng)都起著非常重要的作用，是激活和維持腸道生理功能的關(guān)鍵因素[3]。本文主要通過CCK-8法檢測雙歧桿菌完整肽聚糖干預(yù)SW480細(xì)胞株后細(xì)胞增殖能力的變化，并利用Western-blot法檢測干預(yù)后VEGF、Ki67的表達(dá)水平變化，探討雙歧桿菌完整肽聚糖對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株增殖能力及VEGF、Ki67表達(dá)的影響，并探討其影響腫瘤發(fā)展的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器：結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株(ATCC，CCL-228TM)，Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司，貨號11415-064)，胰蛋白酶(Thermo Fisher公司，貨號12604-021)，培養(yǎng)皿(康寧)，兔抗人多克隆抗體VEGF(Abcam公司，貨號ab9570)、兔抗人多克隆抗體Ki67(Abcam公司，貨號ab15580)，羊多克隆抗兔二抗(北京中杉金橋，貨號ZDR-5306)，還有CCK-8(日本同仁)、凱基全蛋白提取試劑盒、凱基蛋白含量檢測試劑盒、凝膠成像儀(Bio-Rad)等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：SW480在含10% FBS的Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基中(添加0.1%的青霉素、鏈霉素)放置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.3 雙歧桿菌完整肽聚糖干預(yù)實(shí)驗(yàn)：雙歧桿菌完整肽聚糖按梁延春等[4]報(bào)道的方法從分叉雙歧桿菌中提取而成，并經(jīng)過鑒定。通過人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞與不同濃度WPG(20、40、80、160、320、100 μg/mL) 共孵育一定時(shí)間(24 h、48 h和72 h)后，觀察低、中、高濃度WPG對SW480細(xì)胞的殺傷作用。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的抑制率及增殖實(shí)驗(yàn)：在96孔板中配制100 μl的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在37 ℃、CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，向96孔培養(yǎng)板中加入不同濃度(20、40、80、160、320 μg/mL)的WPG溶液，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)，并做無WPG培養(yǎng)基及無CCK-8溶液為陰性、空白對照。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h、48 h和72 h，同時(shí)向每孔加入CCK-8溶液至終濃度為10%。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，計(jì)算WPG對細(xì)胞的抑制率，并計(jì)算IC50，選取最適宜的干預(yù)濃度，選取時(shí)間點(diǎn)(0、24、48、72、96 h)檢測干預(yù)后細(xì)胞增殖能力。

1.5 Western-blot檢測干預(yù)后VEGF、Ki67的蛋白表達(dá)：利用凱基全蛋白提取試劑盒提取全蛋白、凱基蛋白含量檢測試劑盒檢測提取蛋白濃度，配平各蛋白濃度，沸水煮5 min使蛋白變性后-20 ℃保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。配制4%濃縮膠、10%分離膠，用50 μg蛋白量上樣后SDS-PAGE電泳(80 V恒壓電泳2 h左右)，然后4 ℃恒壓150 V濕性電轉(zhuǎn)1 h。用含0.5‰TBST 的5%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白1 h。在含0.5‰TBST 的5%脫脂牛奶中加入一抗VEGF(1∶2 000)、Ki67(1∶1 000)，4 ℃一抗孵育過夜；次日在含0.5‰TBST 的5%脫脂牛奶中加入二抗(羊抗兔1∶5 000)，室溫二抗孵育1 h后用1‰TBST水平搖床清洗，化學(xué)顯影并凝膠圖像顯影拍照并分析。

1.6 結(jié)果判定：CCK-8結(jié)果由Bio-Rad酶標(biāo)儀檢測分析結(jié)果，抑制率=(OD值對照組-OD值干預(yù)組)/OD值對照組。IC50結(jié)果由GraphPad Prism 5.0計(jì)算得出。

Western-blot利用IPP 6.0軟件分析干預(yù)組與對照組IOD(灰度值)及Area(面積)，以GAPDH為內(nèi)參統(tǒng)計(jì)分析干預(yù)組與對照組平均IOD(灰度值)/Area(面積)比值，分析干預(yù)后平均灰度值與未干預(yù)組平均灰度值及相對倍數(shù)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 WPG抑制SW480細(xì)胞增殖能力隨濃度的增加而增強(qiáng)：CCK-8法顯示不同濃度(20、40、80、160、320 μg/mL)干預(yù)SW480細(xì)胞的抑制率不同，且具有濃度依耐性，隨濃度的增加抑制能力增強(qiáng)，見表1。當(dāng)IC50為116.2 μg/mL時(shí)細(xì)胞抑制能力最強(qiáng)，用WPG 116.2 μg/mL干預(yù)后顯示細(xì)胞增殖能力下降，在48 h(F=0.926，P<0.05)、72 h(F=0.867，P<0.05)、96 h(F=1.603，P<0.05)時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在區(qū)間48～72 h差異最為明顯。

表1 不同濃度雙歧桿菌WPG對SW480細(xì)胞的抑制率(%)

2.2 WPG能下調(diào)SW480細(xì)胞株中VEGF、Ki67蛋白的表達(dá)：Western-blot顯示干預(yù)后SW480細(xì)胞株中VEGF(P<0.05)、Ki67(P<0.05) 較對照組蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

雙歧桿菌是人體腸道中具有營養(yǎng)機(jī)體、抑制細(xì)菌生長、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用的益生菌，其在腸道的數(shù)量平衡對維持機(jī)體健康至關(guān)重要[5-10]。雙歧桿菌WPG是一種多糖與膚聚糖聚合而成的袋狀結(jié)構(gòu)，它保持了雙歧桿菌細(xì)胞壁的完整性，在體內(nèi)外均可保留其多種生物學(xué)活性[11]。研究證明，雙歧桿菌WPG對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都具有一定的抑制作用[12]。蔡良真等[13]研究證明，雙歧桿菌WPG 在體外對人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174T具有顯著的選擇性殺傷作用。Sekine等[14]將雙歧桿菌細(xì)胞壁中的完整肽聚糖及細(xì)胞壁骨架分別和MethA 纖維肉瘤細(xì)胞一起混合接種到小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)都能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增長。而Sekine等[15]在研究雙歧桿菌WPG 對T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和綿羊紅細(xì)胞致敏小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌WPG 對小鼠免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，可能在免疫抗腫瘤過程中發(fā)揮重要的作用。而彭艷華等[16]在研究雙歧桿菌脂磷壁酸對不同大腸癌細(xì)胞株LoVo細(xì)胞和HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力及VEGF表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌脂磷壁酸能抑制大腸癌細(xì)胞黏附、侵襲、遷移的能力，能下調(diào)VEGF的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。鄭昌京等[17]將雙歧桿菌注射到大腸癌裸鼠移植瘤動(dòng)物模型中，檢測發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中VEGF及其微血管密度(MVD)明顯低于對照組，可見雙歧桿菌抑制大腸癌的發(fā)展可能是通過下調(diào)VEGF 達(dá)到的。在胃癌、肝癌等其他腫瘤的研究中也有類似報(bào)道[18-19]。

在本研究中，給予不同濃度的WPG與結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株共孵育一定時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，不同濃度WPG對SW480細(xì)胞的抑制率不同，且具有濃度依耐性，即濃度越高對細(xì)胞的抑制能力越強(qiáng)。同時(shí)，我們利用CCK-8法計(jì)算IC50，選取最適宜濃度干預(yù)細(xì)胞后檢測細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)WPG抑制了SW480細(xì)胞株的增殖。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組的VEGF表達(dá)水平較未干預(yù)組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并檢測了與增殖相關(guān)的Ki67基因，發(fā)現(xiàn)干預(yù)組的Ki67表達(dá)水平呈下降趨勢。這些結(jié)果證明，雙歧桿菌完整肽聚糖能抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株的增殖，其抑制腫瘤的發(fā)展可能是通過下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)形成的，但就其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究來證明。

結(jié)合大量的文獻(xiàn)資料及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，雙歧桿菌完整肽聚糖在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，這可為結(jié)直腸癌早期預(yù)防及治療提供一定的指導(dǎo)價(jià)值。但就目前而言，雙歧桿菌完整肽聚糖作用于結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制還需要在進(jìn)一步的研究中去證實(shí)。相信在不久的將來，雙歧桿菌完整肽聚糖在治療腫瘤的過程中會發(fā)揮越來越重要的作用。

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TheeffectsofbifidobacteriumintactpeptidoglycanonproliferationinSW480celllineandtheexpressionofVEGFandKi67incoloncancer

WANGWeijie1,RONGShikuo2,WANGJinkai2,LIhai1.

1.DepartmentofColorectalSurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Correspondingauthor:LIHai,Email:zhuoran1126@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of bifidobacterium intact peptidoglycan (WPG) on the proliferation and expression of VEGF and Ki67 in colon cancer cell line SW480 (colorectal carcinoma cell line).MethodsAfter cultured for 24 hours,48 hours and 72 hours,different concentrations of WPG (20 μg/mL,40 μg/mL,80 μg/mL,160 μg/mL，320 ug/ml),the inhibitory rate of WPG on SW480 cells was detected by CCK-8 method.The expression of VEGF and Ki67 in the SW480 cells was detected by Western-blot.ResultsThe inhibitory rate of SW480 cells treated with different concentrations of CCK-8 (Cell Counting Kit-8) was different,and the cell proliferation was decreased after treated with CCK-8.The expression of VEGF(P<0.05),Ki67(P<0.05) was different compared with that in control group.ConclusionThe complete peptidoglycan of Bifidobacterium can inhibit the proliferation of SW480 cell line and down-regulate the expression of VEGF and Ki67,and inhibit the development of tumor.

WPG;Colorectalcancer;Proliferation;VEGF;Ki67

寧夏醫(yī)科大學(xué)校級科研項(xiàng)目(XM2015066)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，寧夏 銀川 750004 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004

王偉杰(1981-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究工作。

李海，Email：zhuoran1126@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.012.html

10.13621/j.1001-5949.2017.08.0694

R735

A

2017-01-21 [責(zé)任編輯]李 潔