趙 帥，黃允寧，趙良玉，盧 林，李智勇，封存志

·論 著·

pN0胃癌淋巴結微轉移臨床意義的研究

趙 帥1，黃允寧2，趙良玉2，盧 林2，李智勇2，封存志1

目的探索聯(lián)合使用RT-PCR及免疫組織化學染色法(IHC)同時檢測胃癌淋巴結微轉移(LNM)，分析胃癌淋巴結微轉移對胃癌臨床診治的影響。方法選取接受手術的pN0期胃癌患者32例。應用IHC和RT-PCR法聯(lián)合檢測術后淋巴結CK20的表達，分析LNM與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、分化程度等臨床病理資料的關系。結果經IHC法檢測出6例患者、共14個淋巴結中CK20陽性，LNM陽性率為21.87%；經RT-PCR法檢測出10例患者、共23個淋巴結中CK20 mRNA陽性，LNM陽性率為31.25%。兩種方法均為陽性的患者7例，RT-PCR法呈陽性而IHC陰性的患者4例，IHC結果陽性而RT-PCR法陰性患者1例。此研究共檢出11例患者存在LNM。不同分化程度pN0期胃癌LNM間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低分化胃癌較中-高分化胃癌更易出現(xiàn)LNM。結論胃癌LNM與分化程度有關，低分化胃癌較中-高分化胃癌更易出現(xiàn)微轉移，臨床醫(yī)生給低分化胃癌患者采用縮小手術治療方式時需慎重。IHC和RT-PCR法聯(lián)合檢測胃癌INM可提高微轉移的檢出率。

胃癌；微轉移；CK20；免疫組化法；RT-PCR法

淋巴結轉移的嚴重程度與胃癌術后病情發(fā)展呈負相關性[1]。臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)即使接受D2根治手術，術后經常規(guī)病理染色(HE染色)診斷為pN0期的患者，仍然存在術后復發(fā)，甚至因此而死亡。有學者研究提出淋巴結微轉移(LNM)可能是導致這一現(xiàn)象的一個主要原因[2]。隨著分子檢測技術的探索、發(fā)現(xiàn)及應用，免疫組織化學染色技術和RT-PCR技術已成為一個成熟的可進行LNM檢測的分子技術。本研究選取胃腺癌患者術后經常規(guī)病理診斷為pN0淋巴結蠟塊作為檢測標本，采用IHC和RT-PCR法共同檢測其中CK20的表達，分析胃癌淋巴結微轉移與胃癌患者臨床病理資料的相關性，探討胃癌LNM對臨床診治的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象：選取2013年1月-2016年9月在寧夏人民醫(yī)院接受根治性切除術，且術后淋巴結經常規(guī)病理檢測為No期的32例胃癌患者。收集術后淋巴結蠟塊共158個，記錄32例患者的臨床病理資料。術前或術中診斷存在其他部位癌癥或存在其他臟器轉移癌、胰腺受侵及腹腔種植、卵巢轉移等遠處轉移的患者不納入為研究對象。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化實驗方法:主要試劑有CK20抗體(選用武漢三鷹生物有限公司的CK20兔抗人單克隆抗體)、SP9000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒。實驗步驟：常規(guī)石蠟切片5 μm,55 ℃烤片2 h，脫蠟水化，枸櫞酸鈉鹽緩沖液高溫4 min，PBS液浸泡5 min，3次；3%去離子雙氧水37 ℃環(huán)境中15 min，5%山羊血清封閉,37 ℃孵育30 min,傾去血清,滴加一抗工作液,4 ℃中過夜。37 ℃溫箱中復溫1 h，聚合酶輔助劑37 ℃下30 min，PBS洗,5 min× 3次。滴加抗兔IgG二抗,37 ℃孵育30 min，PBS洗，5 min× 3次，DAB顯色2 min，PBS沖洗,蘇木精復染，封片。陽性對照采用常規(guī)病理確診的轉移陽性淋巴結組織，陰性對照采用PBS代替一抗。

1.2.2 RT-PCR實驗步驟

1.2.2.1 引物設計與合成：引物序列采用參考文獻[3]中的CK20引物序列并做修改，由上海生物公程有限公司合成，內參采用β-actin，引物序列見表1。

表1 引物及內參序列

1.2.2.2 實驗耗材：RNA提取試劑盒購于OMEGA公司，逆轉錄試劑盒購于美國 Thermo Scientific公司，Marker Ⅱ由天跟生化技術有限公司合成，β-actin 一抗由武漢博士德生物有限公司合成。

1.2.2.3 RNA提?。?嚴格按照RNA提取試劑盒說明書步驟進行提取，提取出來的RNA在超微量核酸蛋白測定儀上檢測其濃度，放于-80 ℃環(huán)境下保存。

1.2.2.4 擴增及逆轉錄：逆轉錄反應體系為20 μl，RevertAid Reverse Transcriptase 1 μl，5x Reaction Buffer 4 μl，RiboLock RNase Inhibitor 1 μl，dNTP Mix 2 μl，Oligo(dT)1 μl；以2 μg為標準加入相應體積的RNA提取液，再加入相應體積DEPC水，42 ℃×60 min×1個循環(huán)→70 ℃×5 min×1個循環(huán)，以mRNA為模板反轉錄生成cDNA。擴增體系為25 μl，DNA聚合酶復合物12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DEPC水8.5 μl，cDNA 2 μl，94 ℃×2 min×1變性，94 ℃×30 s～56 ℃×30 s～72 ℃×30 s，30個循環(huán)，72 ℃×2 min延伸。

1.2.2.5 電泳及曝光：配置1.5%瓊脂糖凝膠，120 V電壓，10 mA電流跑膠25 min，凝膠成像系統(tǒng)下分析結果。

1.3 統(tǒng)計學方法：使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料使用χ2檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗結果：IHC檢測發(fā)現(xiàn)32例患者中有7例術后LNM陽性，陽性率為21.87%；158個淋巴結蠟塊檢檢測發(fā)現(xiàn)有14個淋巴結蠟塊出現(xiàn)微轉移，檢出率為9%。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)32例患者中共有10例檢測發(fā)現(xiàn)LNM，陽性率為31.25%；158個淋巴結蠟塊中發(fā)現(xiàn)有23個出現(xiàn)微轉移，檢出率為14.93%。

2.2 胃癌淋巴結微轉移與臨床病理資料的關系：收集32例患者臨床病理資料，包括腫瘤大小、浸潤深度、組織學類型等信息。分析發(fā)現(xiàn)，胃癌LNM與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度無相關性，與分化程度有相關性。低分化胃癌較中-高分化胃癌容易發(fā)生LNM(P<0.05)，見表2。

表2 胃癌LNM與胃癌病理資料的關系[n(%)]

臨床病理參數(shù)nIHC陽性P值RT-PCR陽性P值分化程度 中-高分化191(21)<0．053(26)<0．05 低分化136(23)7(38)浸潤深度 未侵犯肌層112(18．2)>0．054(36．4)>0．05 侵犯肌層或超過215(23．8)6(28．6)

3 討論

3.1 胃癌LNM的臨床意義:胃癌LNM與胃癌患者術后復發(fā)及存活率的關系一直是研究的熱點，但是目前兩者的關系，各學者還存在一定分歧[4-7]。但是胃癌LNN與術后胃癌復發(fā)相關，存在LNN的患者，術后復發(fā)的概率較大，得到諸多研究者的同意。

Fukagawa T等通過研究提出，標準胃癌根治術加D2淋巴結清掃術，對于pT2N0或pT3N0胃癌患者是一個恰當?shù)氖中g治療方式[8]。Lee T研究發(fā)現(xiàn)，充分的淋巴結清掃對于未分化胃癌十分重要[9]。2011年中國衛(wèi)計委發(fā)布的《胃癌診療規(guī)范》規(guī)定：ESD和EMR適用于高中分化胃癌，行胃D1切除術時，一旦出現(xiàn)淋巴結轉移，應當施行D2切除術。本研究收集32例患者臨床病理資料，結果顯示，胃癌LNM與胃癌分化程度有相關性；低分化胃癌較中-高分化胃癌容易發(fā)生LNM(P<0.05)。因此，對低分化胃癌患者采用縮小手術治療方式時需慎重。

3.2 IHC與RT-PCR法聯(lián)合檢測胃癌淋巴結微轉移：隨著檢測技術的發(fā)展，IHC檢測胃癌LNM目前得到廣泛的應用，是因為IHC具有特異性高、簡便易行的特點[10-11]。逆轉錄聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)以其高敏感性的特點，也被廣大學者用于LNM的檢測。Kubota等探索發(fā)現(xiàn)，RT-PCR法是檢測微轉移敏感度最高的方法[12]。陳瑞川等研究發(fā)現(xiàn)，RT-PCR法可從105個正常組織細胞中檢出1個惡性細胞，具有較高的敏感度[13]。Koshi Kumagai等使用一步核酸擴增法(OSNA)來檢測胃癌患者淋巴結轉移，并且可在30 min內得出結果[14]。Yanagita等研究發(fā)現(xiàn)一種用于術中評估淋巴結轉移的系統(tǒng)，此系統(tǒng)可以檢驗淋巴結中CEA和CK19的量，在40 min內得出結果[15]。這些研究都為RT-PCR的臨床應用提供了便利。

聯(lián)合使用IHC法和RT-PCR法檢測胃癌LNM，可以從細胞水平及基因水平兩個方面同時對目標標記物進行觀察和分析，兩種方法相互應用，可以提高胃癌LNM的檢出率。

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ClinicalsignificanceoflymphnodemicrometastasisinpN0gastriccancer

ZHAOShuai1,HUANGYunNing2,ZHAOLiangYu2,LULing2,LIZhiYong2,FENGCunzhi1.

1.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750002,China;2.GastrointestinalSurgery,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China

Correspondingauthor:HUANGYunNing,Email:nxhyncc@126.com

ObjectiveTo determine the lymph node metastasis of patients who undergo surgery with negative lymph node metastasis by immunohistochemical staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) with CK20 as the target marker.To explore the two methods of detecting lymph node micrometastasis and the clinical significance of lymph node micrometastasis in gastric cancer.Methods32 patients with pN0 gastric cancer who underwent radical gastrectomy were selected.158 lymph nodes were collected and all lymph nodes were detected by HE staining.pathology diagnosis.The expression of CK20 in lymph nodes was detected by immunohistochemical staining and RT-PCR.To analyze the relationship between lymph node micrometastasis and sex,age,tumor location,tumor size,depth of invasion,histological type and other clinical pathological parameters of gastric cancer.ResultsThere were seven patients and fourteen lymph nodes were positive of lymph node micrometastasis by immunohistochemically stained.The positive rate of lymph node micrometastasis were 21.87%;A total of 10 patients that were detected by RT-PCR lymph node micrometastasis were positive.The expression of CK20mRNA in 23 lymph nodes was detected by reverse transcription PCR.Lymph node micrometastasis detection rate was 31.25%.Seven patients were positive by both methods.There are 4 patients were positive by RT-PCR and negative by immunohistochemistry.One patient had positive immunohistochemical test and negative RT-PCR.There are 11 patients had positive micrometastasis.There was significant difference between different histological types of pN0 gastric cancer patients (P<0.05).Lymph node micrometastases in patients with poorly differentiated gastric cancer were more likely to occur than patients with moderate to well-differentiated gastric cancer.Lymph node micrometastases were associated with histological types of gastric cancer patients,regardless of age,sex,tumor location,tumor size,and depth of invasion.ConclusionThe lymph node micrometastasis of gastric cancer is related to the histological type of gastric cancer.The patients with poorly differentiated gastric cancer are more likely to undergo micrometastasis than those with moderate to well differentiated gastric cancer.It should be careful to reduced surgical treatment to the patients with poorly differentiated gastric cancer.Immunohistochemical method combine with RT-PCR detection can improve the detection rate of micrometastasis.

Gastriccancer;Micrometastasis;CK20;Immunohistochemistry;RT-PCR

寧夏自然科學基金項目(NZ14163)

1.寧夏醫(yī)科大學，寧夏 銀川 750002 2.寧夏人民醫(yī)院胃腸外科，寧夏 銀川 750002

趙帥(1990-)，男，山西籍，在讀碩士研究生，主要從事胃腸外科研究方向。

黃允寧，Email:nxhyncc@ 126.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170814.1453.016.html

10.13621/j.1001-5949.2017.08.0682

R735

A

2017-02-17 [責任編輯]王凱榮