石景雨，何麗蓮，王先宏，劉魯峰，陳疏影，李富生

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

甘蔗葉片中原花青素含量測定及提取工藝的研究

石景雨，何麗蓮，王先宏，劉魯峰，陳疏影，李富生*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

以云南農(nóng)業(yè)大學(xué)自育甘蔗品種“滇蔗01-58”為試驗(yàn)材料，優(yōu)化原花青素的提取工藝，并對比不同類型的甘蔗品種葉片中原花青素的含量。得到結(jié)論，原花青素最高提取率的工藝組合為：提取時(shí)間40min、提取溫度40℃、乙醇濃度90%、料液比是1∶10，萃取率為1.181%。測定的10個(gè)甘蔗栽培種和10個(gè)甘蔗野生種存在差異，其中栽培種葉片中原花青素提取率最高的是滇蔗09-38，野生種葉片中含量最高的是割手密Ⅰ9-56，總體表現(xiàn)為野生種葉片中原花青素的含量高于栽培種。

甘蔗；栽培種；野生種；葉片；原花青素含量；提取率

甘蔗作為制糖作物，其生物產(chǎn)量很高。中國是全世界種植甘蔗最早的國家[1]，目前產(chǎn)量居全世界第三。同時(shí)，甘蔗在生長的過程中長勢迅速，對于土壤的適應(yīng)性很強(qiáng)，是一種喜溫，喜光植物[2]。甘蔗葉片是甘蔗制糖的副產(chǎn)物，占到甘蔗總產(chǎn)量的15%以上[3]。甘蔗中含有多種抗氧化物質(zhì)，包括黃酮類化合物、酚類、甾醇、原花青素和兒茶素等[4]。

原花青素是一類縮合鞣質(zhì)[5]，在自然界中，很多植物都具有原花青素這種化合物，原花青素主要分布在果核、果皮、種子等部位，在植物中具有很強(qiáng)的生物活性[6]。原花青素具有比較強(qiáng)的抗氧化及清除自由基作用[7]，原花青素在心腦血管中主要表現(xiàn)對血管的保護(hù)作用[8]，而且原花青素在抑菌抗炎方面表現(xiàn)出良好的作用，受到外界的影響比較小，具有穩(wěn)定性[9]，原花青素能夠減輕由于化療所引起的骨髓抑制、免疫抑制的作用，并且能夠減輕肝損傷[10]；除了這幾個(gè)方面的作用，原花青素在其他方面也表現(xiàn)出非常良好的活性，如抗?jié)僛11]、抗腫瘤[12]、對免疫系統(tǒng)的作用[13]等。甘蔗葉片中也含有一些原花青素，目前對于甘蔗葉片中原花青素含量的研究僅限于定量分析，但對于原花青素提取工藝方面的研究較少。本試驗(yàn)選用云南農(nóng)業(yè)大學(xué)自育甘蔗品種“滇蔗01-58”作為試驗(yàn)材料，研究甘蔗葉片中原花青素的提取工藝，并對不同類型甘蔗品種間葉片中原花青素的含量進(jìn)行分析。為進(jìn)一步對甘蔗葉片中化合物的有效利用提供理論依據(jù)。

對于植物的抗氧化物質(zhì)的提取方法主要基于水提法和有機(jī)溶劑提取法，根據(jù)研究表明，水提法對物質(zhì)的提取效率不如有機(jī)溶劑提取法。有機(jī)溶劑法提取使用的有機(jī)溶劑主要有：甲醇、乙醇、丙酮等，考慮乙醇溶劑的安全無毒，且價(jià)格低廉，容易回收等特點(diǎn)，故采用乙醇對原花青素進(jìn)行提取。綜合考慮主要對原花青素提取率的影響因素，主要考慮乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比對原花青素提取效率的影響。在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，可以得到原花青素的提取最佳工藝組合（即乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比的工藝組合），在這個(gè)工藝組合下，對不同類型的甘蔗品種葉片中原花青素進(jìn)行提取，并進(jìn)行對比分析。從而為甘蔗葉片的工廠化生產(chǎn)提供理論研究基礎(chǔ)，可以延長甘蔗的產(chǎn)業(yè)鏈。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為20種不同類型的甘蔗植株，其中10種為甘蔗栽培品種（系），10種為甘蔗野生種（見表3）。材料均種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗資源圃，該資源圃位于昆明黑龍?zhí)叮颇限r(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，海拔1930 m，試驗(yàn)材料為成熟期葉片。材料的選擇上，選擇正常、無病，代表成熟的甘蔗種植，+1葉片（最上一片完全葉）。

1.2 試驗(yàn)試劑和設(shè)備

主要試劑：原花青素（標(biāo)準(zhǔn)品），美國simga公司；甲醇；香草醛；濃鹽酸；乙醇；去離子水等。主要儀器：紫外分光光度計(jì)（Agilent Technologies公司）、電子天平、打碎機(jī)、恒溫水浴鍋等。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用乙醇浸提法對原花青素進(jìn)行提取。首先在不同的提取條件下，對“滇蔗01-58”甘蔗葉片中原花青素的提取率進(jìn)行研究，篩選出最佳的提取范圍。在這個(gè)范圍基礎(chǔ)之上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化這4個(gè)因素的交互作用。從而得到最佳的提取工藝組合。

1.3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取原花青素10mg，加入10 mL的甲醇，配置成溶液濃度為1.0mg/mL的原花青素母液，配置0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，加入6.0mL的4%香草醛-甲醇溶液和3.0mL濃鹽酸，搖勻，在室溫下靜置15min，以濃度為0 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白，在500nm的波長處測定吸光值，以吸光度作為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由圖1可以得到原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=1.7566x+0.0196，R2=0.9981，線性關(guān)系良好。

1.3.2 樣品處理將待測樣品離心后取上清液1.0mL置于試管中，加入6.0mL的4%香草醛-甲醇溶液和3.0mL濃鹽酸，在室溫下靜置15min，在500nm的波長處測定吸光值。通過原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸直線方程，可以計(jì)算出甘蔗葉片中原花青素的提取率。

提取率（%）=C×N×V/100M

式中：C為根據(jù)所測樣品溶液中吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的原花青素的溶液濃度，mg/m L；N為稀釋倍數(shù)；V為所測樣品體積，mL；M為所測樣品的質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 提取溫度對甘蔗葉片中原花青素提取率的影響分別稱取3.0g甘蔗葉片，粉碎，放置于錐形瓶中，按料液比為1∶20加入75%的乙醇溶液60mL，分別放入30、40、50、60、70℃的水浴中提取40min，每個(gè)溫度梯度分別做3個(gè)對照試驗(yàn)，待測定后取平均值。分別對提取液進(jìn)行離心、過濾，放入4℃冰箱中待用。

1.4.2 提取時(shí)間對甘蔗葉片中原花青素提取率的影響分別稱取3.0g的甘蔗葉片，粉碎，分別置于錐形瓶中。按料液比為1∶20加入75%的乙醇溶液60mL，分別放入50℃的水浴中提取10min、20min、30min、40min、50min。每個(gè)時(shí)間梯度分別做3個(gè)對照試驗(yàn)，待測定后取平均值。得到提取液之后，對提取液進(jìn)行離心、過濾。得到上層清液，放入4℃的冰箱之中冷藏保存。

1.4.3 提取料液比對甘蔗葉片中原花青素提取率的影響分別稱取3.0g的甘蔗葉片，粉碎，分別置于錐形瓶中。分別按料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入75%的乙醇溶液。將錐形瓶放入50℃的水浴中提取40min。每個(gè)料液比梯度分別做3個(gè)對照試驗(yàn)，待測定后取平均值。得到提取液之后，對提取液進(jìn)行離心、過濾。得到上層清液，放入4℃的冰箱之中冷藏保存。

1.4.4 乙醇濃度對甘蔗葉片中原花青素提取率的影響分別稱取3.0g的甘蔗葉片，粉碎，分置于錐形瓶中。按照料液比1∶20分別加入30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液，放入50℃的水浴中提取40min。每個(gè)乙醇濃度梯度分別做3個(gè)對照試驗(yàn)，待測定后取平均值。得到提取液之后，對提取液進(jìn)行離心、過濾。得到上層清液，放入4℃的冰箱之中冷藏保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 水浴溫度對原花青素提取率的影響如圖2所示，原花青素的提取率在不同的溫度條件下出現(xiàn)的結(jié)果不相同，在水浴溫度40℃左右時(shí)，原花青素提取率出現(xiàn)最大值，高此溫度逐漸下降。這可能和原花青素遇熱不穩(wěn)定有關(guān)。對原花青素的提取溫度范圍可以確定為30～50℃。

2.1.2 提取時(shí)間對原花青素提取率的影響見圖2，隨著時(shí)間的推移，原花青素的提取率也隨之增加，這可能是浸提的時(shí)間越長，原花青素溶解于乙醇溶液的濃度越高有關(guān)，但當(dāng)時(shí)間超過40min之后，隨著時(shí)間的延長，原花青素的提取率反而降低。這可能和浸提時(shí)間過長，原花青素在溶液中分解有關(guān)。因而，原花青素的提取時(shí)間范圍確定為30～50min。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of procyanidin

圖2 不同提取時(shí)間和溫度對原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of temperature and time on procyanidin extraction rate

2.1.3 不同料液比對原花青素提取率的影響在圖3中可以看到在料液比為1∶15的時(shí)候，原花青素的提取率最高。隨著乙醇溶液用量的增加，提取出來的原花青素的含量又出現(xiàn)下降。這就表明，在其他條件一致的情況下，可以選擇料液比的范圍為1∶10～1∶20。

2.1.4 不同乙醇濃度對原花青素提取率的影響

如圖3所示，在乙醇濃度低于75%時(shí)，原花青素的提取率會(huì)隨著乙醇濃度的增加而增加，但是當(dāng)乙醇濃度超過75%的時(shí)候，原花青素的含量隨著乙醇濃度的增加而下降。因而可以選擇乙醇濃度在60%～90%。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2．1的單因素試驗(yàn)結(jié)果，可以得到浸提時(shí)間范圍是30～50min，水浴溫度的范圍是30～50℃，乙醇濃度的范圍是60%～90%，料液比的范圍是1∶10～1∶20。根據(jù)這幾個(gè)范圍設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)因素水平和試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，甘蔗葉片中含有一些原花青素成分，在提取時(shí)間為50min，提取溫度為50℃，乙醇濃度為90%，料液比為1∶10的情況下，原花青素的提取率最高，達(dá)到1．103%。通過對極差的比較可知，對于影響原花青素提取率的幾個(gè)因素中，可以看出影響原花青素提取率的因素影響程度為：乙醇濃度＞料液比＞浸提時(shí)間＞水浴溫度，因而影響原花青素提取率最大的因素是乙醇濃度，影響最小的是水浴溫度。

對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可以看出，根據(jù)K值反應(yīng)該因素水平對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，可以得出：A因素的K值在2條件下有最大值，B因素的K值在2條件下有最大值，C因素的K值在3因素條件下有最大值，同時(shí)，D因素在1條件下有最大值，因而對原花青素的提取率的最佳組合為A2B2C3D1，但是該組合不在表1中，因而要對表中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和得到的最佳組合進(jìn)行聯(lián)合分析，然后在這個(gè)基礎(chǔ)之上完成對比試驗(yàn)，對比試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證如表2所示。

根據(jù)表2的結(jié)果所示，發(fā)現(xiàn)正交試驗(yàn)得到的最佳提取條件組合大于正交設(shè)計(jì)表中出現(xiàn)的最大值，這就反應(yīng)出，正交試驗(yàn)優(yōu)化所得的最佳提取條件是原花青素的最佳提取條件。甘蔗葉中原花青素的最佳提取條件：40min浸出時(shí)間、水浴溫度40℃，90%的乙醇濃度、固液比1∶10。在這種情況下，“滇蔗01－58”原花青素的萃取率是1．181%。

2.3 不同甘蔗栽培品種（系）和不同野生種原花青素提取率

根據(jù)2．2的結(jié)論，可以得出在提取時(shí)間40min，提取溫度40℃，乙醇濃度為90%，料液比為1∶10，甘蔗葉片中的原花青素有最大提取率。因而根據(jù)這個(gè)條件對不同品種（系）的甘蔗葉片中原花青素進(jìn)行提取，得到不同品種中原花青素的提取率如表3所示。

通過表3可以看出，10個(gè)不同栽培品種（系）的原花青素提取率的范圍在0．0855%～1．354%之間，由高到低順序?yàn)椋旱嵴?9－38＞新臺(tái)糖22＞滇蔗02－7＞滇蔗04－14＞桂糖11＞滇蔗01－58＞新臺(tái)糖10＞滇蔗01－106＞滇蔗11－138＞滇蔗11－485。其中滇蔗09－38的原花青素提取率最高，達(dá)到1．354%，而最低的是滇蔗11－485，原花青素提取率為0．855%。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與原花青素提取結(jié)果Tab.1 The design and results of procyanidin extraction using orthogonal test

表2 原花青素提取最優(yōu)工藝組合對比Tab.2 The comparison of optimal craft combination of procyanidin extraction

圖3 不同料液比和乙醇濃度對原花青素提取率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration on procyanidin extraction rate

表3 不同甘蔗品種(系)葉片中原花青素提取率Tab.3 The procyanidin extraction rate on different sugarcane varieties

10個(gè)不同野生種原花青素的提取率為1．070%～1．372%，由高到低順序?yàn)椋焊钍置堍?－56＞蔗茅90－43＞割手密88－269＞割手密83－191＞五節(jié)芒Ⅰ91－27＞五節(jié)芒Ⅱ91－52＞美蔗茅IND81－001＞斑茅93－59＞斑茅Ⅱ91－125＞斑茅Ⅰ91－39，其中原花青素提取率最高的為割手密Ⅰ9－56，提取率為1．372%，最低的為斑茅Ⅰ91－39，提取率為1．070%。

通過分析可知，P值為0．055，對于所測定的20個(gè)栽培種和野生種甘蔗葉片中原花青素的含量而言，差異顯著。通過表3中原花青素提取率的平均值可以看出，甘蔗野生種中原花青素提取率的平均值為1．2327%，高于甘蔗栽培品種（系）的原花青素的提取率的平均值1．0983%。在這20種不同的甘蔗葉片中，原花青素提取率最高的是割手密Ⅰ9－56（1．372%），最低的是滇蔗11－485（0．855%）。在10種不同類型的野生種中，割手密類原花青素提取率的平均值為1．334%，斑茅類原花青素提取率的平均值為1．094%，蔗茅類原花青素提取率的平均值為1．2625%，五節(jié)芒類原花青素提取率的平均值為1．2585%?？梢钥闯?，在不同類型的野生種的甘蔗葉片中，原花青素的提取率的大小為：割手密＞蔗茅＞五節(jié)芒＞斑茅。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)對原花青素提取率的工藝研究中，選用的提取溶劑為乙醇，乙醇具有成本低廉，安全無毒，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，且乙醇溶劑容易回收。在本試驗(yàn)中采用了正交試驗(yàn)，探討了乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度和料液比幾個(gè)因素對原花青素提取率的影響。通過優(yōu)化得到最佳提取工藝：提取溫度40℃、提取時(shí)間40min、乙醇濃度90%、料液比是1∶10，甘蔗品種“滇蔗01－58”原花青素的萃取率是1．181%，為提取甘蔗葉片中原花青素的含量提供了理論依據(jù)。在試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)栽培種甘蔗葉片中原花青素的含量低于野生種的甘蔗葉片中的含量，差異表現(xiàn)出顯著性，這可能和甘蔗的遺傳以及對環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)。對甘蔗葉片中原花青素含量的分析可以為甘蔗的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

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Optimization of Assay and Extraction Technology of Procyanidin in Sugarcane Leaves

SHI Jing－yu,HE Li－lian,WANG Xian－h(huán)ong,LIU Lu－feng,CHEN Shu－ying,LI Fu－sheng*
(College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,Yunnan)

Sugarcane variety Dianzhe 01－58 selected by Yunan Agricultural University was used as material,the craft conditions of procyanidine extraction was optimized and compared with procyanidine content of different sugarcane varietiy leaves．The results showed that the optimal extracting combination were temperature 40℃，ethanol concentration 90%(V/V),duration 40 min，and solid－liquid ratio 1:10,under above conditions,extraction rate was 1．181%．Different types sugarcane(cultivars and wild germplasms)of leaves contain different levels of procyanidin．Dianzhe 09－38 showed the highest levels of procyanidin in the sugarcane cultivars and"Saccharum spontaneum L．Ⅰ9－56"showed the highest levels of procyanidins in wild sugarcane germplasms,on the whole the procyanidin content of wild species were higher than that of cultivated species．

sugarcane;cultivar;wild species;leaves;procyanidin content;extraction rate

S566.101

A

1007－2624（2017）05－0005－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.05.002

2017-05-10

云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目；云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（云科人發(fā)[2012]18號(hào)）；云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2015Z103）。

石景雨（1992-），女，安徽舒城人，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士；研究方向：甘蔗資源研究與利用。

李富生（1968-），男，河南確山人，博士，教授，博導(dǎo)；研究方向：甘蔗資源研究與利用。E-mail：729709711@qq.com