孫文靜 蘭丹梅 楊洋 賀斌

快速動眼睡眠剝奪對大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力及海馬組織自噬的影響

孫文靜 蘭丹梅 楊洋 賀斌

目的 探討快速動眼(rapid eye movement,REM)睡眠剝奪后與大鼠認知相關(guān)的行為學(xué)變化及腦內(nèi)海馬組織中自噬相關(guān)蛋白的表達水平。方法 健康成年雄性大鼠經(jīng)過篩選后分為空白對照組(CC組)、環(huán)境對照組(TC組)、睡眠剝奪組(SD組)，每組各6只；采用改良多平臺睡眠剝奪法(modified multiple platform method，MMPM)建立睡眠剝奪模型，連續(xù)剝奪5 d后利用Morris水迷宮檢測大鼠認知功能；用蛋白質(zhì)印記法(Western Blot，WB)檢測自噬相關(guān)微管蛋白(LC3)及SQSTM1/P62的表達水平變化。結(jié)果 與CC組和TC組比較，SD組大鼠毛色無光澤、易激惹、體重下降(P<0.05)。SD組與其他2組比較，逃逸潛伏期延長、目標象限時間減少(P<0.05)。WB顯示SD組與其他2組比較，大鼠腦內(nèi)海馬組織自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達水平上升，P62水平下降(P<0.05)。CC組與TC組大鼠比較，體重、學(xué)習(xí)記憶能力、海馬組織自噬蛋白表達水平均無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 睡眠剝奪后可損害大鼠學(xué)習(xí)及記憶功能，海馬組織中自噬水平上調(diào)提示自噬活動可能參與睡眠剝奪介導(dǎo)的認知功能障礙過程。

睡眠剝奪 自噬 海馬 認知功能

睡眠剝奪是指由于各種原因引起的睡眠時間或質(zhì)量的下降，并導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶、認知心理等機體功能異常的狀態(tài)[1]。睡眠不足已經(jīng)被公認為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)發(fā)病的重要危險因素[2-3]，兩者互為因果，惡性循環(huán)，但其中機制尚不明確[4-5]。

自噬即自我吞噬,是一種普遍存在的由溶酶體介導(dǎo)的降解過程，在維持細胞內(nèi)物質(zhì)的合成、降解平衡以及參與細胞成分的有序再利用，在營養(yǎng)匱乏或疾病狀態(tài)下自噬可被激活，出現(xiàn)特征性的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。已有文獻報道AD腦內(nèi)特征性病理改變的主要成分—β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)在自噬-溶酶體系統(tǒng)中產(chǎn)生并降解[6]，且多數(shù)AD患者發(fā)病早期即存在自噬溶酶體功能障礙[7-8]。但自噬活動是否參與睡眠剝奪所致的認知功能障礙這一過程，目前少有相關(guān)報道。本研究主要通過建立快速動眼睡眠剝奪大鼠模型，通過觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶功能、腦內(nèi)海馬組織自噬活動的改變，以探討自噬在睡眠剝奪介導(dǎo)認知障礙中可能發(fā)揮的作用，為認知障礙提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年雄性SD大鼠(由第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供)，體質(zhì)量220～250 g(n=18)。標準實驗環(huán)境中飼養(yǎng)(光照12 h、溫度21～22 ℃、濕度50%)，并隨機分為3組：空白對照組(CC組)(n=6)、環(huán)境對照組(TC組)(n=6)、睡眠剝奪組(SD組)(n=6)。

1.2 實驗試劑 10%水合氯醛(中國武漢協(xié)和醫(yī)院)、RIPA裂解液(碧云天生物科技研究所)、BCA蛋白定量檢測試劑盒(碧云天生物科技研究所)、Anti-LC3B antibody(Abcam,UK)、P62抗體(Proteintech Group, USA)、β-actin(Abcam,UK)、蛋白Marker (Therm Fermentas)、TBS緩沖液(武漢谷歌生物科技)。

1.3 模型制備 采用改良多平臺REM睡眠剝奪法(modified multiple platform method，MMPM)建立REM睡眠剝奪模型[9]；SD組剝奪水槽放置兩排平臺，每排8個平臺，在水槽內(nèi)注水，水溫保持在22 ℃左右，水面距平臺約1.0 cm，大鼠在平臺上可自行攝食飲水，并可在平臺間活動；當(dāng)大鼠進入REM睡眠時，由于全身肌肉張力降低，節(jié)律性地垂頭觸水而覺醒，從而使大鼠始終不能進入REM睡眠期，造成REM睡眠剝奪；TC組裝置與睡眠剝奪組類似，但平臺直徑較大，大鼠睡眠時不會落入水中；實驗前將各組大鼠放在同一籠中飼養(yǎng)，并將大鼠放在平臺上適應(yīng)3 d，每天適應(yīng)1 h，水槽中的水每天更換；CC組常規(guī)標準飼養(yǎng)。

1.4 大鼠狀態(tài)觀察 觀察各組大鼠毛發(fā)整齊度及色澤變化，有無腳趾、鼠尾的出血破潰，是否存在激惹好斗等現(xiàn)象，并記錄大鼠進食水量及體重變化。

1.5 行為學(xué)觀察 實驗前3 d及睡眠剝奪5 d、大鼠熟悉環(huán)境3 d后采用Morris水迷宮(上海吉量科技公司)測試系統(tǒng)測量大鼠定位及空間探索能力，由監(jiān)視探頭記錄實驗過程，每只大鼠在同一平臺上游泳，記錄大鼠找到平臺逃逸的潛伏期、游泳總路程及總速度，記錄3次并計算平均值。允許其在120 s內(nèi)找到平臺，找到后繼續(xù)保持20 s；若在120 s內(nèi)找不到平臺，則將大鼠引導(dǎo)至平臺上保持20 s,記錄潛伏期為120 s。

1.6 大鼠腦內(nèi)自噬水平的測定 每組6只大鼠在相應(yīng)時間點經(jīng)10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后快速斷頭取腦，在冰上分離出海馬組織，迅速以液氮處理后一80 ℃凍存；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠腦內(nèi)LC3及P62蛋白表達水平；將海馬組織解凍后超聲震碎，用試劑盒提取蛋白，加入蛋白裂解液并手動勻漿，4 ℃13000 r/min離心15 min,取上清液，BCA蛋白定量檢測試劑盒定量；樣本經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入自噬相關(guān)抗體LC3B(工作濃度為1∶1000)、P62(工作濃度為1∶2000)以及β-actin(工作濃度為1∶1000)4 ℃過夜，TBST清洗后加入HRP標記抗大鼠二抗或抗兔二抗(工作濃度均為1∶3000)，室溫下孵育30 min后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次(每次5 min)，用顯影、定影試劑進行顯影和定影后根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件后觀察。以LC3II、P62目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶光密度值代表各產(chǎn)物的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài)變化 隨REM睡眠剝奪后大鼠的行為和生理變化日益明顯，大鼠能量消耗增加、疲憊、皮毛蓬亂無光澤、體重下降，且攻擊性增強，對聲音等環(huán)境刺激的警覺性、反應(yīng)性也增強，因易激惹扒搔后爪子也有損傷，表現(xiàn)為腳趾粘膜破損出血，而TC組及CC組大鼠行為正常，體重較實驗前增加(圖1)。

圖1 睡眠剝奪后大鼠體重變化 與SD組比較，?P<0．05

2.2 行為學(xué)觀察 REM剝奪后SD組與TC、CC組比較，逃逸潛伏期延長，目標象限時間縮短(P<0.05)，但TC組與CC組比較，逃逸潛伏期及目標象限時間變化均不大(p>0.05)(圖2)。

圖2 睡眠剝奪后大鼠行為學(xué)改變與SD組比較?P<0．05

2.3 大鼠海馬組織自噬活動變化 REM剝奪后SD組大鼠TC、CC組比較，腦內(nèi)海馬組織自噬微管相關(guān)蛋白LC3-II表達水平上升，而P62蛋白表達水平下降(P<0.05)。TC組與CC組比較，大鼠海馬組織中兩種蛋白的表達水平變化不明顯(P>0.05)(圖3)。

3 討 論

AD是最常見的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為智力與認知功能減退以及行為和人格改變。近年來研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪是AD的重要發(fā)病因素，著名的AD病專家Pan在2014年度發(fā)文稱睡眠障礙可導(dǎo)致AD，呼吁控制睡眠障礙，以減少AD的發(fā)生[10]。Aβ沉積形成的老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD腦內(nèi)特征性的病理改變[11]。Aβ的生成增多或降解減少是腦內(nèi)Aβ沉積的基本原因。由于Aβ在自噬-溶酶體系統(tǒng)中產(chǎn)生并降解，所以自噬溶酶體功能障礙均可導(dǎo)致Aβ降解減少、Aβ沉積[12]，多數(shù)AD患者發(fā)病早期即存在自噬溶酶體功能障礙[13]。自噬與溶酶體功能的平衡可能是AD的關(guān)鍵機制[14]，在AD發(fā)病機制中自噬泡形成障礙[15]、自噬泡的轉(zhuǎn)運障礙[16]、自噬泡與溶酶體融合障礙[17]、溶酶體功能障礙[17]等任一環(huán)節(jié)障礙均可導(dǎo)致Aβ的降解減少，導(dǎo)致Aβ異常沉積及認知障礙。

圖3 睡眠剝奪后大鼠海馬組織自噬水平的變化 與SD組比較?P<0．05

自噬過程由一系列自噬相關(guān)基因(Atg)編碼的對應(yīng)蛋白參與完成，LC3是酵母Atg8在哺乳動物中的同源物，分為I型和Ⅱ型，被認為是自噬發(fā)生的標志，自噬激活時LC3I轉(zhuǎn)換為LC3-II[18]。p62為一種多結(jié)構(gòu)域的支架蛋白，結(jié)合泛素化修飾的蛋白，并將其運送至自噬泡中降解。自噬發(fā)生時p62蛋白被不斷降解。自噬功能缺陷或活性減弱時p62蛋白在細胞質(zhì)中不斷積累。因此，p62水平可作為反映自噬活性的指標[19]。

本實驗研究結(jié)果進一步驗證了睡眠剝奪可以導(dǎo)致認知行為能力下降。隨著剝奪時間的延長，大鼠的空間學(xué)習(xí)能力受到了明顯的損害。同時，海馬作為腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)中調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的中樞，睡眠剝奪后對其組織中自噬水平進行檢測后發(fā)現(xiàn)，SD組大鼠海馬區(qū)LC3-II蛋白水平上升，p62水平下降，且與其他2組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明快速動眼期睡眠剝奪可引起大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)自噬水平上調(diào)。與邱紅艷等人發(fā)表的慢性睡眠剝奪對小鼠腦內(nèi)自噬水平的影響結(jié)果一致[20]。提示自噬活動參與睡眠剝奪后認知功能損傷這一過程。但就其具體機制，需進一步研究，從而尋求包括AD在內(nèi)的神經(jīng)疾病治療的新方案。

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(2016-12-01收稿)

Effects of rapid eye movement sleep deprivation on cognitive and autophagy in rat hippocampus

SunWenjing，LanDanmei，YangYang，etal.

DepartmentofNeurology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003

Objective To investigate the effects of rapid eye movement(REM) sleep deprivation(SD) on the learning and memory abilities,and the changes of autophagy in the rat hippocampus．Methods Healthy adult male Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into sleep deprivation(SD) group,Treatment control(TC) group and circumstance control(CC) group, and each group included 6 rats. The sleep deprivation model was established by the modified multiple platform method(MMPM). After 5 days of measure, morris water maze was used to test the cognitive function of rats, and the hippocampal LC3-II and P62 protein levels were detected by western blot method.Results Compared with CC and TC groups, SD rats were exhausted and irritated.The weight of SD rats was considerably decreased from the third day of sleep deprivation(P<0.05). The escape latencies of SD group were obviously increased and rates of SD group spent significantly less time in the target quadrant than those of control group (P<0.05). Compared with the control group, the protein expression of LC3-II was significantly increased as P62 significantly decreased in the SD group(P<0.05). At the same time, there were no significant differences between the CC group and TC group.Conclusion SD could be the reason which leaded to the decrease of learning and memory abilities, increased the expression of LC3-Ⅱ and P62，elevated the formation of autophagosome, and suggested that autophagy might be involved in the cognitive impair induced by sleep deprivation．

Sleep deprivation Autophagy Hippocampus Cognitive function

長征醫(yī)院青年啟動基金(海藻糖通過誘導(dǎo)自噬抑制慢性睡眠剝奪所致Aβ沉積及機制研究)(2015CZQN03)

200003 上海，解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[孫文靜 蘭丹梅 楊洋 賀斌(通信作者)]

R742

A

1007-0478(2017)04-0328-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.012