柯國秀 王國軍 王建生 金梅芳 張軍 嚴(yán)俊

早期繼續(xù)出血的自發(fā)性腦出血患者不同時間點氧化應(yīng)激及炎性介質(zhì)水平的變化

柯國秀 王國軍 王建生 金梅芳 張軍 嚴(yán)俊

目的 探討早期繼續(xù)出血的自發(fā)性腦出血患者氧化應(yīng)激及炎性介質(zhì)水平的變化。方法 選取腦出血繼續(xù)出血患者(觀察組)與非繼續(xù)出血患者(穩(wěn)定組)、健康對照組(對照組)各48例，分別檢測各組不同時間點的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6 的水平變化。結(jié)果 各時間點觀察組、穩(wěn)定組的MDA、SOD、TNF-α和IL-6水平均明顯高于對照組，(P<0.01)；與穩(wěn)定組比較，觀察組各時間點的MDA、SOD、TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05)，且在出血早期(24～48 h)氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)最為顯著(P<0.05)。結(jié)論 氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)可能共同參與了自發(fā)性腦出血早期繼續(xù)出血的發(fā)生及發(fā)展，可能是繼續(xù)出血的機制之一。

自發(fā)性腦出血 早期繼續(xù)出血 氧化應(yīng)激 炎性介質(zhì)

在我國自發(fā)性腦出血(Spontaneous intracerebral hemorrhage,SICH)的病死率和致殘率均較高，近年來研究發(fā)現(xiàn)20%～40%的患者在發(fā)病后24 h內(nèi)血腫仍繼續(xù)擴大，為活動性出血或早期繼續(xù)出血[1]。此類患者急性期病情惡化與早期繼續(xù)出血有關(guān)。本研究旨在探討氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)水平對自發(fā)性腦出血早期繼續(xù)出血的影響，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

自2013年1月～2015年12月入住本科的SICH患者中選取腦出血繼續(xù)出血患者(觀察組)與非繼續(xù)出血患者(穩(wěn)定組)各48例另取來院體檢健康者的健康對照組(對照組)48例，所有病例發(fā)病時間均<24 h，均于入院前經(jīng)頭顱CT確診，發(fā)病24 h內(nèi)復(fù)查頭顱CT。觀察組血腫擴大評定：血腫體積按多田方法計算，即血腫體積=長×寬×CT掃描陽層/2,排除血腫破入腦室系統(tǒng)或蛛網(wǎng)膜下腔。根據(jù)Kuazui等方法確定血腫擴大的界限值為V2-V1≥12.5 cm3或V2/V1≥1.4(V2，V1為第2、1次腦CT示血腫體積)。入選標(biāo)準(zhǔn)為自發(fā)性腦出血，非外傷或其他外來因素所致；發(fā)病后至少存活2周并能夠完成CT檢查；排除(1)入院前4周內(nèi)服用維生素E等抗氧化藥物者；(2)孕婦、哺乳期婦女；(3)既往有神經(jīng)外科手術(shù)史，合并惡性腫瘤、嚴(yán)重自身免疫性疾病者、血液疾病、出血性腦梗死；(4)高熱，急、慢性感染性疾病，貧血，嚴(yán)重營養(yǎng)不良者；(5)女性患者服用避孕藥及激素類藥物；(6)自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦室出血者。入選96例患者，其中男64例，占66.7%；女32例，占33.3%；年齡38～79歲，平均年齡(60±9.48)歲。既往有高血壓病史者77例，占80.2%，有糖尿病史者29例，占30.2%，長期飲酒者9例，占9.38%，有腦梗死者18例，占18.8%，肝功能異常者4例，占4.17%；小劑量長期服用阿司匹林腸溶片者27例，占28.1%；服用華法林者1例，占1.0%。健康對照組年齡42～72歲，平均年齡(58.8±10.05)歲。各組性別、年齡均衡(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)指標(biāo)水平檢測 分別抽取所有檢測者發(fā)病后24、48、72 h、2周的肘靜脈血,以檢測血清SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平，5 mL靜脈血室溫放置2 h,以2 000 r/min離心10 min,提取血清100 μL,放置- 70 ℃冰箱保存,用同一批號試劑測定。嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明書制備樣品和檢測，包括采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平；采用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD水平；采用ELISA法測定血清IL-6水平；采用免疫放射免疫法測定腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)的水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時間點MDA水平的檢測

觀察組、穩(wěn)定組在各個時間點檢測出的MDA水平均顯著增高，與對照組比較，有明顯差異(P<0.01)；與穩(wěn)定組比較，觀察組的MDA水平顯著升高(P<0.05)，觀察組在發(fā)病后48 h檢測出的MDA水平達(dá)到了峰值，與其他檢測時間點比較有明顯差異(P<0.05)(表1)。

表1 各組不同時間點MDA的變化

注：與對照組比較,*P<0.01；與穩(wěn)定組比較，△P<0.05；與觀察組內(nèi)其他時間點比較，▲P<0.05

2.2 各組不同時間點SOD水平的檢測

觀察組、穩(wěn)定組在各個時間點檢測出的SOD水平均顯著增高，與對照組比較，有明顯差異(P<0.01)；與穩(wěn)定組比較，觀察組的SOD水平顯著升高(P<0.05)，觀察組在發(fā)病后48 h檢測出的SOD水平達(dá)到了峰值，與其他檢測時間點比較有明顯差異(P<0.05)(表2)。

表2 各組不同時間點SOD的變化

注：與對照組比較，*P<0.01；與穩(wěn)定組比較，△P<0.05；與觀察組內(nèi)其他時間點比較，▲P<0.05

2.3 各組不同時間點TNF-α水平的檢測

觀察組、穩(wěn)定組在各個時間點檢測出的TNF-α水平均顯著增高，與對照組比較，有明顯差異(P<0.01)；與穩(wěn)定組比較，觀察組的TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，觀察組在發(fā)病后24 h檢測出的TNF-α水平達(dá)到了峰值，與其他檢測時間點比較有明顯差異(P<0.05)(表3)。

表3 各組不同時間點TNF-α的變化

注：與對照組比較，*P<0.01；與穩(wěn)定組比較，△P<0.05；與觀察組內(nèi)其他時間點比較，▲P<0.05

2.4 各組不同時間點IL-6水平的檢測

觀察組、穩(wěn)定組在各個時間點檢測出的IL-6水平均顯著增高，與對照組比較，有明顯差異(P<0.01)；與穩(wěn)定組比較，觀察組的IL-6水平顯著升高(P<0.05)，觀察組在發(fā)病后24 h檢測出的IL-6水平達(dá)到了峰值，與其他檢測時間點比較有明顯差異(P<0.05)(表4)。

表4 各組不同時間點IL-6的變化

注：與對照組比較，*P<0.01；與穩(wěn)定組比較，△P<0.05；與觀察組內(nèi)其他時間點比較，▲P<0.05

3 討 論

成人自發(fā)性腦出血(Spontaneous intracerebral hemorrhage,SICH)是指非外傷引起的成人腦部大、小動脈、靜脈和毛細(xì)血管自發(fā)性破裂所致腦實質(zhì)內(nèi)出血。因其自發(fā)性，往往癥狀突然出現(xiàn)，且較危重，SICH通常在最初數(shù)小時內(nèi)迅速進(jìn)展，因此臨床上需要進(jìn)行快速診斷及相關(guān)治療，而在早期繼續(xù)出血是急性期腦出血進(jìn)行性惡化的重要因素，對早期繼續(xù)出血患者的氧化應(yīng)激、炎性介質(zhì)水平研究有助于對這部分患者病情發(fā)生發(fā)展機制的探討，為臨床的診療策略帶來新的思考。

本研究各時間點觀察組及穩(wěn)定組的MDA、SOD水平均明顯高于對照組(P<0.01)，而進(jìn)一步與穩(wěn)定組比較，觀察組MAD、SOD水平升高更為顯著，有明顯差異(P<0.05)。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化物和抗氧化物失衡而造成的機體潛在損傷狀態(tài)，是產(chǎn)生過多或/和機體抗氧化能力減弱，ROS清除不足，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)增多并引起氧化損傷的病理過程。出血性腦卒中時體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)自由基和MDA等有害化學(xué)基團迅速增多，導(dǎo)致線粒體功能障礙，加重細(xì)胞興奮毒性，促進(jìn)神經(jīng)元脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA過氧化損傷和炎癥反應(yīng)等，因而認(rèn)為氧化應(yīng)激是出血性腦卒中時腦損傷的基本機制之一[2]。丙二醛(MDA)作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其水平的變化間接地反映了組織中氧化自由基水平的變化。因此，通過測定MDA水平可以估價腦組織中氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強弱。體內(nèi)自由基的清除主要依賴抗氧化系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化系統(tǒng)的主要酶之一，用于催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，使細(xì)胞免除自由基的損傷，SOD的水平升高是自由基大量生成和脂質(zhì)過氧化增強的結(jié)果，是應(yīng)激性反應(yīng)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，各組在發(fā)病后48 h檢測出的MDA及SOD水平達(dá)到了峰值。動物研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)腦出血性模型大鼠在腦出血后24～48 h腦水腫達(dá)到高峰, 與腦內(nèi)氧自由基活性增高的時間一致[4]。在膠原酶所致腦出血動物模型研究中顯示，腦出血30 min皮下注射自由基清除劑NXY-059可減少血腫鄰近組織的神經(jīng)損傷、中性粒細(xì)胞浸潤以及細(xì)胞凋亡[5]。依達(dá)拉奉作為自由基清除劑在日本最早被用于缺血性腦卒中，也有動物研究表明在腦出血后即刻皮下注射此藥物可減輕腦水腫及神經(jīng)功能缺損，減少DNA 氧化損傷[6]。在我國腦出血急性期使用依達(dá)拉奉仍存在爭議，而有研究對依達(dá)拉奉治療急性期腦出血Meta分析中共納入22個研究(2089例患者),Meta分析顯示依達(dá)拉奉能促進(jìn)腦出血患者的神經(jīng)功能恢復(fù),可用于腦出血急性期的治療。但由于納入文獻(xiàn)質(zhì)量級別比較低,尚需高質(zhì)量、多中心的隨機對照試驗進(jìn)一步驗證[7]。

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)感染、創(chuàng)傷及免疫應(yīng)答反應(yīng)，同其他細(xì)胞因子共同參與機體的生長發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。TNF-α為觸發(fā)因子，腦組織損傷后星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞首先表達(dá)TNF-α，由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6等炎性介質(zhì)共同參與炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性腦出血時TNF-α是最早升高的細(xì)胞因子，能促進(jìn)炎性細(xì)胞的活化，釋放炎性介質(zhì)，增強中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的黏附作用，誘導(dǎo)IL-6等其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8]。蘇健等[9]對早期腦出血患者血清中TNF-α、IL-6的表達(dá)量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，患者的TNF-α、IL-6水平明顯增高。促炎性細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1可刺激活化IL-6。腦出血患者血清IL-6水平明顯升高，IL-6作為炎性反應(yīng)免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，參與腦出血后損傷的機制為激活中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)黏附分子表達(dá)，并可促使中性粒細(xì)胞釋放大量的活性氧和彈性蛋白酶，對血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞造成直接損傷，加重腦組織水腫及神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡[10-11]。在動物試驗中血管緊張素Ⅱ受體亞型AT1受體阻滯劑替米沙坦被認(rèn)為具有減少炎細(xì)胞浸潤及腦水腫的作用，同時降低炎性分子水平，包括TNF-α，F(xiàn)as及FasL，上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表達(dá)，減少腦出血量、水腫及細(xì)胞凋亡作用[12]。

本研究結(jié)果表明，腦出血急性期MDA及SOD水平持續(xù)增高, 其中早期繼續(xù)出血患者增高更為顯著，而與TNF-α和IL-6 相比較則MDA及SOD具有滯后性。研究發(fā)現(xiàn)，機體活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)在腦損傷后由嗜中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及活化的小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞釋放，SICH的腦組織損傷主要是由腦出血灶的占位效應(yīng)及血液成分釋放引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)造成，而后者被認(rèn)為是SICH后2次損傷的始動環(huán)節(jié)[13]。本研究提示炎性介質(zhì)可能參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)的啟動及釋放，而氧化應(yīng)激又參與了炎性免疫損傷的惡性級聯(lián)過程。因此，盡早對腦出血患者特別是早期繼續(xù)出血患者進(jìn)行抗炎及抗氧化應(yīng)激聯(lián)合治療有可能減少再出血及后續(xù)損傷。減少早期繼續(xù)出血是降低腦出血致殘率及致死率的有效途徑，本研究對其機制的探索為腦出血治療提供新的方向，目前相關(guān)臨床研究仍較少，需要更多動物試驗及大規(guī)模多中心臨床試驗進(jìn)一步推動相關(guān)治療的研究進(jìn)展。

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(2016-10-16收稿)

Changes of oxidative stress and inflammatory mediators in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage in early stage

KeGuoxiu，WangGuojun，WangJiansheng，etal.

DepartmentofNeurology,theNO.1PeopleHospitalofChangshu,Changshu215500

Objective To study the levels of oxidative stress and the changes of inflammatory mediators in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage.Methods 144 patients were equally classified into the observation group, which was comprised of continuous hemorrhage after spontaneous cerebral hemorrhage, and the stable group formed by non-continuous hemorrhage after spontaneous cerebral hemorrhage, and the control group consisted of healthy control group. The changes of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) and IL-6 levels would be separately analyzed at different points in time.Results It was found that the contents of MDA, SOD, TNF alpha and IL-6 in the observation group and the stable group were significantly higher than that in the control group (P<0.01), while compared with the stable group, the contents of the observation group at each time point increased significantly (P<0.05), and inflammatory reaction was the most significant (P<0.05) in hemorrhage early (48h) oxidative stress.Conclusion Oxidative stress and inflammatory response might be associated with the occurrence and development of spontaneous intracerebral hemorrhage, and might be one of the mechanisms of continuing hemorrhage. It was prompted for patients that the early intervention was taken, the more profitable could be benefited.

Spontaneous intracerebral hemorrhage Early continue bleeding Oxidative stress Inflammatory mediators

215500 江蘇省常熟市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

R743.34

A

1007-0478(2017)04-0306-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.007