吳 榕，鄭國華，郝玉蘭

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010022；2.呼和浩特市蔬菜技術(shù)推廣站，內(nèi)蒙古 呼和浩特010070）

1984年，Rice提出“化感作用（allelopathy）是植物或微生物的化學(xué)分泌物對(duì)環(huán)境中其他植物或微生物的有利或不利的效應(yīng)，即生化互作”。他涵蓋了植物之間、微生物之間以及植物和微生物之間的相互作用，而且主要物質(zhì)是植物或微生物的次生代謝產(chǎn)物，即化感物質(zhì)［1］。白三葉草是世界上分布較廣的一類草坪草，既可以綠化環(huán)境，也可以用于飼料。白三葉草坪中常混生有很多種雜草，如稗草（Echinochloacrus-galli（L.）Beauv）、苘麻（AbutilontheophrastiMedic.）、蓼（Polygonum）、反枝莧（Amaranthusretroflexus.L.）、野燕麥（AvenafatuaL.）、 蒲 公 英（Taraxacum mongolicumHand.）等20多種雜草，這些雜草對(duì)于白三葉的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，既影響美觀，同時(shí)還造成牲畜中毒，經(jīng)研究證明，白三葉具有化感作用，充分利用其化感作用可以減少雜草對(duì)白三葉的侵害［2-5］。

研究表明，白三葉中的化感物質(zhì)有很多種，已報(bào)道的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃花草木樨（MelilotusofficinalisDesr.）、白三葉（TrifoliumrepensL.）、紅三葉（TrifoliumpretenseL.）、雜 三 葉（Trifolium hybridumL.）等豆科植物普遍含有丁香酸、香草酸、原兒茶酸、香豆酸、乙酸異戊酯、二氫香豆酮以及肉桂酸等多種酚酸類和類黃酮化感物質(zhì)［6］。其中類黃酮類是一大類重要的次生代謝產(chǎn)物，在生物化感作用中有十分重要的作用。在植物體內(nèi)類黃酮的生物合成途徑普遍存在，并產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱為類黃酮化合物，查爾酮合成異構(gòu)酶是類黃酮化合物代謝中的關(guān)鍵酶類，直接影響到類黃酮的代謝過程［7-9］?？寺〔闋柾铣僧悩?gòu)酶基因（CHS）對(duì)于白三葉化感物質(zhì)中類黃酮的產(chǎn)生和提純具有應(yīng)用價(jià)值，所克隆的基因是控制白三葉化感物質(zhì)的關(guān)鍵基因，如將克隆到的CHS基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，在白三葉或模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）、煙草（Nicotianatabacum）中表達(dá)，對(duì)基因的功能進(jìn)行分析，同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因植物對(duì)白三葉CHS基因?qū)S酮類代謝物質(zhì)的含量、組成加以影響，進(jìn)一步分析黃酮類代謝物質(zhì)的變化，闡述黃酮類物質(zhì)和植物化感作用之間的關(guān)系等，對(duì)于白三葉化感物質(zhì)的進(jìn)一步應(yīng)用有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與菌種 植物材料白三葉‘龍坪1號(hào)’（Trifoliumrepens‘Longping No1’），大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 本研究用到的主要試劑如表1所示：

1.2 方法

1.2.1 引物的合成及測(cè)序

1.2.1.1 白三葉CHS基因中間片段的簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)［10］

在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索不同植物查爾酮合成酶（CHS）基因的氨基酸和核苷酸序列，利用生物學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)分析，尋找基因序列的保守區(qū)域；使用Primer Premier 5.0根據(jù)氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。引物序列如下：

利用TRIzol試劑提取白三葉RNA，去DNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照Clontech公司RACE試劑盒說明書進(jìn)行RACE試驗(yàn)獲得cDNA全長(zhǎng)。

1.2.1.2 RACE引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)白三葉CHS基因中間片段的測(cè)序結(jié)果，按照Clontech公司RACE試劑盒說明書要求，使用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)5′RACE反應(yīng)所需目的基因的下游特異性引物和3′RACE反應(yīng)所需目的基因的上游特異性引物。引物序列如下：

本研究的引物合成和測(cè)序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.2 序列分析 利用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）的Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，CDD程序分析蛋白保守區(qū)域，用ORF finder工具（http：//wncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.ht ww.ml）分析開放閱讀框。利用 ExPASy（http：//www.expasy.org/proteomics）數(shù)據(jù)庫中的ProtParam軟件對(duì)推導(dǎo)氨基酸序列的分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、蛋白穩(wěn)定性、總親水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。GOR4進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過Expasy數(shù)據(jù)中的SWISS-MODEL工具（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源比對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)家族 Pfam 數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/）進(jìn)行蛋白保守區(qū)域分析。Clustx進(jìn)行多重序列比對(duì)，并利用Mega5進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，算法采用鄰接法，bootstrap值設(shè)置為1000。

大豆、苜?；蛐蛄袕闹参锘蚪M數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.com/）獲得；擬南芥基因從擬南芥基 因組 數(shù) 據(jù) 庫 TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）中獲得；其他植物基因從GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉總RNA的提取

白三葉總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，電泳結(jié)果顯示：28SrRNA，18SrRNA，5SrRNA的條帶清晰，無拖帶現(xiàn)象；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280的值均＞2.0，OD260/OD230＞1.8，說明所提取的RNA純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 白三葉總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis examination of total RNA of Trifolium repens

2.2 白三葉CHS基因中間片段的克隆與測(cè)序結(jié)果分析

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到了的條帶位于750bp和1000bp之間，與預(yù)期大小一致，結(jié)果如圖2所示。將該片段切膠回收后連入pEASY-T1Simple載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于LB平板培養(yǎng)。藍(lán)白斑和菌落PCR挑選重組子后搖菌，菌液送上海生工測(cè)序，得到916bp的序列。

圖2 白三葉CHS基因中間片段PCR電泳圖Fig.2 Amplification of the CHSgene fragments by PCR fromTrifolium repens

利用Vector NTI Advance 10.3將白三葉CHS基因cDNA中間片段核苷酸序列推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列。經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTP工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，白三葉CHS中間片段編碼的氨基酸序列與苜蓿（Medicagosativa）、豌豆（Pisumsativum）、大豆（Glycinemax（L.）Merr）等其他豆科植物CHS蛋白氨基酸序列的相似度高達(dá)95%以上，因此推斷克隆到的是白三葉CHS基因中間片段。可以利用該中間片段的已知序列設(shè)計(jì)RACE引物，克隆基因cDNA全長(zhǎng)。

2.3 白三葉CHS基因cDNA全長(zhǎng)克隆

利用已測(cè)序中間片段序列設(shè)計(jì)的RACE引物，通過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的白三葉CHS基因cDNA 3′末端序列和5′末端序列。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物如圖3所示。

其中1，2泳道為5′RACE結(jié)果，大小約750 bp，3，4泳道為3′RACE結(jié)果，大小約500bp。兩條電泳條帶大小都與預(yù)期相似。

圖3 白三葉CHS基因RACE電泳結(jié)果Fig.3 RACE PCR products of the CHSgene fragments by PCR of Trifolium repens

將電泳條帶切膠回收，回收到的目的條帶與pEASY-T1Simple載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR和酶切鑒定出陽性克隆后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

測(cè)序后得到477bp的3′末端序列和724bp的5′末端序列，將克隆得到的5′RACE序列、3′RACE序列和中間片段的測(cè)序結(jié)果用Vector NTI Advance 10.3拼接得到白三葉CHS基因1473bp長(zhǎng)的cDNA序列，利用NCBI的BLAST工具進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示該基因與同屬豆科的大豆、紫花苜蓿（Medicagosativa）和銀合歡（Leucaenaglauca（L.）Benth.）的CHS高度同源，說明克隆到的確實(shí)是白三葉CHS基因，該基因具有調(diào)控白三葉類黃酮化感物質(zhì)前體查爾酮的功能。

在GeneBank中Blast的結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)有三葉草CHS基因的報(bào)道，說明首次從白三葉中克隆得到了CHS基因。

2.4 白三葉CHS基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 核苷酸分析 對(duì)克隆得到的CHS基因進(jìn)行序列分析，利用NCBI中的ORF finder工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析預(yù)測(cè)CHS基因cDNA序列的開放閱讀框。結(jié)果表明克隆到的CHS基因cDNA全長(zhǎng)序列1473 bp，其中包含了1170bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，103bp的5′UTR和200bp3′UTR，編碼389氨基酸。該基因的cDNA序列及所編碼的氨基酸序列如圖4所示。

圖4 白三葉CHS基因的cDNA全長(zhǎng)及編碼的氨基酸序列Fig.4 Full-length of cDNA and amino acid sequences of CHS

2.4.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和氨基酸組成 用Ex-PASy的ProtParam進(jìn)行預(yù)測(cè)表明：白三葉CHS基因編碼的蛋白分子量為42.803kDa，等電點(diǎn)5.75；不穩(wěn)定系數(shù)-1.69。

白三葉CHS基因編碼氨基酸殘基組成情況如表2所示。

2.4.3 白三葉CHS基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用 HNN（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa＿automat.pl？page=/NPSA/npsa＿h(yuǎn)nn.html）在線分析軟件分析預(yù)測(cè)本蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。從分析結(jié)果看，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有無規(guī)則卷曲、α螺旋和β折疊，其中組成無規(guī)則卷曲的氨基酸有160個(gè)，占41.13%；組成α螺旋的氨基酸殘基有156個(gè)，占40.10%；組成β折疊的氨基酸殘基有73個(gè)，占總數(shù)的18.77%。這3種結(jié)構(gòu)較為均勻的分布在整個(gè)蛋白序列中。

2.4.4 白三葉CHS基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用Expasy數(shù)據(jù)庫中的SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）同源建模工具中的Automatic Mode算法進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。將白三葉CHS氨基酸序列提交到數(shù)據(jù)庫后，檢索獲得一個(gè)同源性較高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)1suiC，以該蛋白序列的結(jié)構(gòu)信息為原子模型數(shù)據(jù)庫自動(dòng)進(jìn)行同源建模，結(jié)果如圖6所示。該蛋白總體呈球形，β折疊主要埋藏于蛋白內(nèi)部，α螺旋主要分布在蛋白外部。

表2 白三葉CHS基因編碼蛋白氨基酸殘基組成情況Table 2 Amino acid compositions of protein coded by CHSgene of Trifolium repeus

圖5 白三葉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.5 The secondary structure prediction of the CHSby HNN

圖6 同源建模得出的白三葉CHS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure prediction of the CHSby SWISS-MODE

2.4.5 白三葉CHS基因編碼蛋白親水性分析應(yīng)用ExPAS數(shù)據(jù)庫中的ProtScale工具（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.Pl）對(duì)白三葉CHS基因編碼蛋白進(jìn)行了親水性分析。正值越大表示該區(qū)域越疏水，負(fù)值越大表示該區(qū)域越親水，介于+0.5到-0.5之間的主要為兩性氨基酸。由圖7可知，該蛋白中疏水性氨基酸較多，總體呈疏水性質(zhì)。其中最大疏水性的氨基酸出現(xiàn)在351和352位，達(dá)到-2.911，而最大親水性出現(xiàn)在342位，達(dá)到2.422。而由ExPASy的ProtParam預(yù)測(cè)的親水性是-0.125，同樣屬于疏水蛋白，二者結(jié)果一致。

圖7 白三葉CHS氨基酸序列親/疏水性分析Fig.7 Predicted hydropathy plot of the deduced amino acid sequence of the CHS

2.4.6 白三葉CHS基因進(jìn)化分析 在GeneBank數(shù)據(jù)庫中找到其他植物中的CHS基因，包括豌豆（Pisumsativum，P51081.1），苜蓿（Medicagotruncatula，XP＿003601648.1），鷹嘴豆（Cicerarietinum，XP＿004502226.1），陸地棉（Gossypiumhirsutum，ACH56521.1），水 稻（Oryzasativa，BAB39764.1）， 銀 白 楊（Populusalba，ABD24222.1），歐洲榛（Abiesalba，ABD38593.1），馬鈴薯（Solanumtuberosum，AGU70032.1），玉米（Zeamays，NP＿001149508.1），北美白松（Pinus strobus，CAA06077.1），矮牽牛（Petunia xhybrida，AF233638＿1），大豆（Glycinemax，AAB01004.1），虎杖（Polygonumcuspidatum，ABK92282.2），葡萄（Vitisvinifera，NP＿001267879.1），擬南芥（Arabidopsisthaliana，NP＿196897.1）

圖8 白三葉CHS基因進(jìn)化分析Fig.8 Evolution analysis of CHSgene of Trifolium repeus

用這些基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖8所示。圖中可以看出，白三葉CHS與同屬于豆科的苜蓿CHS、大豆CHS、鷹嘴豆CHS和豌豆CHS親緣關(guān)系最近，處于同一分支，而其不同科植物處于其他分支上，這與植物的分類關(guān)系是一致的。而單子葉植物水稻、玉米的CHS與白三葉CHS關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

類黃酮是一大類重要的次生代謝產(chǎn)物，類黃酮的合成途徑是目前研究較為清晰的次生代謝途徑［11］，植物類黃酮合成的前期途徑都是以香豆酰CoA和丙二酰CoA為前體，香豆酰CoA來自苯丙烷合成途徑（Phenylpropanoid pathway），丙二酰CoA來自乙酰CoA，二者在查爾酮合成酶（CHS）作用下形成查爾酮，這一步是類黃酮途徑的第一個(gè)限速步驟［12］。本研究首次從白三葉中克隆得到了調(diào)控類黃酮代謝的CHS基因，而這一基因在GeneB-nak中Blast的結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的報(bào)道，并對(duì)白三葉CHS基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，對(duì)克隆得到的CHS基因，利用NCBI中的ORF finder工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析預(yù)測(cè)CHS基因cDNA序列的開放閱讀框。結(jié)果表明克隆到的CHS基因全長(zhǎng)cDNA序列1473 bp，其中包含了1170bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，103bp的5′UTR和200bp3′UTR，編碼389個(gè)氨基酸。同時(shí)預(yù)測(cè)到白三葉CHS基因編碼的蛋白分子量為42.803kDa，等電點(diǎn)5.75；不穩(wěn)定系數(shù) -1.69。CHS基因所編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊主要埋藏于蛋白內(nèi)部，而α螺旋主要分布于蛋白外部，該蛋白主要呈球形。從CHS基因編碼的蛋白質(zhì)的親水性分析，該蛋白中疏水性氨基酸較多，總體呈疏水性質(zhì)。在CHS基因進(jìn)化分析中，從GeneBank數(shù)據(jù)庫中找到其他植物中的CHS基因，有這些基因的氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，白三葉CHS與同屬于豆科的苜蓿CHS、大豆CHS、鷹嘴豆CHS和豌豆CHS親緣最近，而單子葉植物水稻、玉米的CHS與白三葉CHS關(guān)系較遠(yuǎn)。

據(jù)以上基因信息推測(cè)，所克隆的基因是控制白三葉化感物質(zhì)的關(guān)鍵基因，下一步計(jì)劃將克隆到的CHS基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，在白三葉或模式植物擬南芥（煙草）中表達(dá)，對(duì)基因的功能進(jìn)行分析。利用轉(zhuǎn)基因植物對(duì)白三葉CHS基因?qū)S酮類代謝物質(zhì)含量、組成的影響，進(jìn)一步分析黃酮類代謝物質(zhì)變化對(duì)白三葉化感作用帶來的影響，闡述黃酮類物質(zhì)和植物化感作用之間的關(guān)系。