馮國(guó)麗

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563000)

甲狀腺癌組織中HMGB1、NF-κB p50的表達(dá)及相關(guān)性

馮國(guó)麗

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563000)

目的探討甲狀腺癌組織中高遷移率族蛋白(HMG)B1、核因子(NF)-κB p50的表達(dá)及相關(guān)性。方法選擇該院甲狀腺乳腺外科2014年3月至2016年3月收集的100例甲狀腺癌組織標(biāo)本，另選擇同期該院收集的腺瘤組織20例、甲狀腺腫組織20例、正常組織20例作為對(duì)照，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)各組織HMGB1、NF-κB p50的表達(dá)情況及相關(guān)性。結(jié)果甲狀腺癌組織HMGB1、NF-κB p50陽(yáng)性表達(dá)顯著高于腺瘤組織、甲狀腺腫組織和正常組織(P<0.05)。甲狀腺癌組織中HMGB1、NF-κB p50陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡、組織類型無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。甲狀腺癌組織中HMGB1表達(dá)與NF-κB p50表達(dá)呈正相關(guān)(Rs=0.743，P=0.000)。結(jié)論甲狀腺癌組織中HMGB1、NF-κB p50呈異常表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，HMGB1、NF-κB p50高表達(dá)可能與甲狀腺癌的發(fā)病有關(guān)。

甲狀腺癌組織；HMGB1；核轉(zhuǎn)錄因子p50

甲狀腺癌占頭頸部腫瘤的90%以上〔1〕。目前關(guān)于甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，其中Ras、myc、met等多種癌基因異常激活以及p53、p16等抑癌基因的失活在甲狀腺癌發(fā)病中起到重要作用〔2〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1是一種重要的核內(nèi)結(jié)合蛋白，在基因的重組、復(fù)制、修復(fù)中起重要作用。研究表明，HMGB1可以通過(guò)激活Ras信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞異常增殖〔3〕。核因子(NF)-κB p50是NF-κB的重要成員，可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔4〕。本研究探討甲狀腺癌組織中HMGB1、NF-κB p50的表達(dá)及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科2014年3月至2016年3月收集的100例甲狀腺癌組織標(biāo)本，納入標(biāo)準(zhǔn)：均取自手術(shù)切除的新鮮組織，并經(jīng)手術(shù)和病理確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性腫瘤；近1個(gè)月內(nèi)接受放、化療治療者；其他內(nèi)分泌疾病患者。甲狀腺癌患者包括68例乳頭狀癌、30例濾泡癌及2例髓樣癌，其中男30例，女70例，年齡41～75〔平均(52.3±5.8)〕歲，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，腫瘤直徑≥1.0 cm 65例，<1.0 cm 35例；另外收集20例甲狀腺腺瘤患者的甲狀腺腺瘤組織，其中男6例，女14例，年齡42～72〔平均(51.5±4.9)〕歲；20例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，其中男7例，女13例，年齡41～75〔平均(50.9±6.2)〕歲；20例正常的甲狀腺組織，其中男7例，女13例，年齡40～76〔平均(51.5±6.7)〕歲，各組性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1蘇木素-伊紅(HE)染色 (1)脫蠟處理；(2)進(jìn)行水化；(3)在1%的鹽酸酒精中分化1～3 s，用清水沖洗10～30 s去掉分化液；(4)用0.5%伊紅水液染色處理1～4 min，用蒸餾水過(guò)洗1～2 s；(5)進(jìn)行梯度酒精脫水；(6)將切片浸泡在二甲苯中5 min；(7)中性樹膠封片。

1.2.2免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶鏈接(SP)法染色 使用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)HMGB1及NF-κB p50在甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤、甲狀腺腫、甲狀腺正常組織中的表達(dá)。(1)熔蠟：把組織切片從4℃冰箱中取出，放置在60℃烤箱烘烤約半小時(shí)；(2)脫蠟水化處理；(3)清洗；(4)抗原進(jìn)行熱修復(fù)：HMGB1及NF-κB p50依據(jù)抗體的具體要求使用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)處理；(5)阻礙內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶活性；(6)封閉非特異性抗原；(7)滴加兔抗人HMGB1一抗、兔抗人NF-κB p50一抗，試劑盒購(gòu)自上海田源生物技術(shù)有限公司；(8)在第2日取出濕盒，放在室溫之下約1 h，使其恢復(fù)至室溫，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次沖洗5 min；(9)滴加二抗，試劑盒購(gòu)自上海田源生物技術(shù)有限公司；(10)滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素液；(11)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色；(12)復(fù)染以及分化；(13)梯度酒精脫水以及封片。免疫組化試劑盒購(gòu)自上海信譽(yù)科技有限公司，兔抗人HMGB1多克隆抗體。使用已知的HMGB1及NF-κB p50陽(yáng)性表達(dá)的甲狀腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，染色結(jié)果均呈陽(yáng)性，使用PBS代替一抗作為陰性空白對(duì)照，染色結(jié)果作為陰性。

1.3結(jié)果評(píng)定 HMGB1及NF-κB p50依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)確定免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)〔5〕：陽(yáng)性細(xì)胞百分率<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；細(xì)胞質(zhì)不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以上兩者乘積為綜合得分，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～6分為陽(yáng)性()，>6分為強(qiáng)陽(yáng)性()，陽(yáng)性率為+、以及例數(shù)之和與總例數(shù)的占比。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)法。

2 結(jié) 果

2.1甲狀腺癌、非癌組織中HMGB1蛋白表達(dá) 甲狀腺癌組織HMGB1陽(yáng)性率(70.00%，-30例，+25例，24例，21例)顯著高于腺瘤組織(30.00%，-14例，+3例，3例，0例)、甲狀腺腫組織(25.00%，-15例，+2例，2例，1例)和正常組織(10.00%，-18例，+1例，1例，0例)(χ2=36.826,P=0.000)。

2.2甲狀腺癌、非癌組織中NF-κB p50表達(dá) 甲狀腺癌組織NF-κB p50陽(yáng)性率(72.00%，-28例，+25例，26例，21例)顯著高于腺瘤組織(35.00%，-13例，+3例，4例，0例)、甲狀腺腫組織(30.00%，-14例，+3例，2例，1例)和正常組織(10.00%，-18例，+2例0例，0例)(χ2=36.211,P=0.000)。見(jiàn)表1。

2.3甲狀腺癌組織中HMGB1、NF-κB p50與患者臨床病理特征的關(guān)系 甲狀腺癌組織中HMGB1、NF-κB p50陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡、組織類型無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 甲狀腺組織中HMGB1、NF-κB p50與臨床資料的相關(guān)性〔n(%)〕

2.4甲狀腺癌中HMGB1、NF-κB p50表達(dá)的相關(guān)性 甲狀腺癌中HMGB1表達(dá)與NF-κB p50表達(dá)呈正相關(guān)(Rs=0.743，P=0.000)。其中NF-κB p50+,HMGB1+62例，-10例；NF-κB p50-，HMGB1+8例，-20例。

3 討 論

甲狀腺癌約占全身惡性腫瘤的1%〔6〕。有報(bào)道顯示我國(guó)甲狀腺癌發(fā)病率每年增長(zhǎng)4%。鏡下形態(tài)學(xué)的病理診斷是甲狀腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)〔7〕。但該診斷方法對(duì)于甲狀腺病變的鑒別仍有一定困難。近年來(lái)分子診斷在惡性腫瘤的診斷中起到了重要作用。

HMGB1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，HMGB1主要存在于細(xì)胞核〔8〕。當(dāng)外界有適當(dāng)?shù)男盘?hào)刺激細(xì)胞時(shí)，HMGB1賴氨酸殘基被乙?；缓筢尫诺郊?xì)胞外，在DNA的重組、復(fù)制和修復(fù)中起到重要的作用。Liao等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以通過(guò)激活Ras和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞異常增殖，在細(xì)胞惡變中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤中HMGB1呈高表達(dá)〔10〕。NF-κB為轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的重要成員，包括Rel、p65、RelB、p50和p52 5個(gè)亞單位，其中p50和p52為同源二聚體，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)通常各自以其前體形式存在，當(dāng)遇到有害刺激時(shí)，p50和p52 加入細(xì)胞核中，并改變細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)癌變的發(fā)生〔11〕。研究證實(shí)，NF-κB p50與食管癌、胰腺癌、肝癌等惡性腫瘤有關(guān)〔12〕。本研究結(jié)果符合Kalra等〔13〕和Vuong等〔14〕研究結(jié)果。表明HMGB1、NF-κB p50與甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。Liao等〔9〕的研究結(jié)果推測(cè)其可能機(jī)制是NF-κB p50在多種促癌因素作用下上調(diào)抗細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，抑制了細(xì)胞凋亡，而HMGB1可以通過(guò)激活Ras和MAPK信號(hào)促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞異常增殖，從而起到促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)生的作用。另外本研究結(jié)果提示HMGB1、NF-κB p50的表達(dá)與甲狀腺癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，HMGB1、NF-κB p50在甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到重要作用，而通過(guò)對(duì)甲狀腺癌組織HMGB1、NF-κB p50表達(dá)情況的檢測(cè)可以對(duì)甲狀腺癌的輔助診斷提供參考依據(jù)。

本研究還提示HMGB1與NF-κB p50可能共同參與甲狀腺癌的發(fā)病。筆者推測(cè)NF-κB p50可能通過(guò)上調(diào)抗細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，促進(jìn)HMGB1的表達(dá)，兩者在甲狀腺癌的發(fā)病中起到協(xié)同作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。而臨床上通過(guò)HMGB1、NF-κB p50的聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高甲狀腺癌的診斷率，為臨床治療提供依據(jù)。

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〔2017-01-07修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

馮國(guó)麗(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事普外科方面的研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4286-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.056