陳杰民 涂 昌 程 飛 劉瑞杰 梁逸仙 夏文豪 蘭 軍 潘偉彪

(東莞市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 東莞 523326)

葉酸對老年冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響

陳杰民 涂 昌 程 飛 劉瑞杰 梁逸仙 夏文豪1蘭 軍 潘偉彪

(東莞市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 東莞 523326)

目的探討老年冠心病患者口服葉酸治療對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量及功能的影響。方法選擇初次診斷為冠心病的老年患者60例，隨機分為治療組和對照組，每組30例，在規(guī)范的冠心病二級預(yù)防基礎(chǔ)上，治療組給予葉酸5 mg/d口服，對照組口服安慰劑。在入院時、服藥4 w及8 w時檢測兩組患者的同型半胱氨酸(Hcy)和血流介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能(FMD)水平，并利用外周血分離單個核細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別觀察其集落形成、增殖及遷移能力。結(jié)果DiL-acLDL(紅色)和FITC-UEA-1(綠色)染色雙陽性的細(xì)胞可鑒定為EPCs。與對照組比較，治療組治療8 w EPCs數(shù)量、遷移及增殖能力顯著增高〔(67.70±4.09)個vs(48.92±3.55)個，(34.03±3.43)%vs(27.54±4.24)%，(0.67±0.04)%vs(0.54±0.04)%，P<0.05〕，F(xiàn)MD水平顯著增高〔(7.63±1.67)%vs(5.36±1.33)%，P<0.05〕，Hcy水平顯著降低〔(10.37±0.84)μmol/L vs(12.23±0.74)μmol/L，P<0.05〕。EPCs數(shù)量、遷移、增殖能力與Hcy水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.668,P<0.05;r=-0.657,P<0.05;r=-0.775,P<0.05)，F(xiàn)MD水平與Hcy水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.718，P<0.05)。結(jié)論老年冠心病患者口服葉酸可增高外周血EPCs的數(shù)量、遷移及增殖能力，改善血流介導(dǎo)的FMD，這可能與葉酸降低Hcy水平有關(guān)。

冠心病；內(nèi)皮祖細(xì)胞；同型半胱氨酸；葉酸

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)能夠增殖并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與微血管的新生、損傷血管的修復(fù)和內(nèi)皮功能的維持，在抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用〔1〕。EPCs數(shù)量及功能下降與多種因素有關(guān)，高同型半胱氨酸(Hcy)血癥在當(dāng)中發(fā)揮了重要作用，高Hcy血癥可抑制EPCs的增殖、遷移和存活，延緩血管內(nèi)皮的修復(fù)〔2〕。葉酸是Hcy代謝過程中的輔酶，其缺乏可引起血漿中Hcy升高，補充葉酸已被證實可有效降低老年患者血漿Hcy水平〔3〕，但是否對EPCs的數(shù)量以及功能產(chǎn)生影響，目前國內(nèi)外的報道較少。本研究通過觀察老年冠心病患者在口服葉酸前后外周血EPCs的數(shù)量及功能的變化，探討補充葉酸對老年冠心病患者可能的獲益。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年7月至2014年6在東莞市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科收治的初次診斷為冠心病的老年患者60例，男36例，女24例，年齡60～75〔平均(67.37±3.95)〕歲，所有患者經(jīng)冠狀動脈造影或冠狀動脈CT血管造影(CTA)檢查，任何一支冠狀動脈主要分支狹窄≥50%診斷為冠心病。隨機將患者分為治療組和對照組，每組30例。按規(guī)范的冠心病二級預(yù)防方案給予阿司匹林、β受體阻滯劑和他汀類藥物。在此基礎(chǔ)上，治療組給予葉酸5 mg/d口服，對照組口服安慰劑。所有受試對象均排除腫瘤、感染、自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全等疾病。此研究符合人體試驗委員會制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均同意加入研究并簽署知情同意書。兩組患者男性比例、高血壓、糖尿病、吸煙史、年齡、空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2方法

表1 兩組人群基礎(chǔ)指標(biāo)比較

1.2.1基線數(shù)據(jù)檢測 受試對象均詳細(xì)詢問病史，記錄年齡和吸煙史，測量并記錄血壓，檢測各項生化指標(biāo)，常規(guī)檢查胸部X線、心電圖、心臟彩色超聲和腹部B超，排除腫瘤等其他疾患。入院時、服藥4、8 w時檢測患者的Hcy和血流介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能(FMD)水平，并利用外周血分離單個核細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別觀察其集落形成、增殖及遷移能力。

1.2.2FMD測定 患者取仰臥位，充分暴露左上臂，使用7.5 MHz的超聲探頭(飛利浦IE33超聲心動圖儀)進(jìn)行檢測。探頭放置于左側(cè)肘窩上方3～5 cm處，充分顯示肱動脈的長軸二維圖像，取得最佳直線動脈血液界面和最大肱動脈內(nèi)徑。首先測定基礎(chǔ)的肱動脈內(nèi)徑，然后將血壓計的袖帶綁在左側(cè)肘部，充氣并加壓至200 mmHg，加壓4 min后迅速放氣減壓，放氣60～90 s內(nèi)再次測定肱動脈內(nèi)徑。FMD值以充血后反應(yīng)性的肱動脈內(nèi)徑和基礎(chǔ)的肱動脈內(nèi)徑之間變化的百分比表示。

1.2.3EPCs培養(yǎng)與鑒定 抽取患者的外周血20 ml，使用密度梯度離心法獲得單個核細(xì)胞。將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)7 d后，加入0.02 mg/ml的DiI-acLDL溶液(采購自美國Molecular Probe公司)，在37℃下孵育2 h；用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，然后加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗2次。完成上述步驟后，加入0.01 mg/ml的FITC-UEA-1溶液(采購自美國Sigma公司)，37℃下孵育1 h；加入10 μg/ml的二脒基苯基吲哚溶液，37℃下孵育5 min。最后，使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細(xì)胞為EPCs。EPCs培養(yǎng)第7天后，在40倍顯微鏡鏡下隨機選取3個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取平均值。

1.2.4EPCs遷移能力檢測 首先在改良Boyden小室下室加入含有50 ng/ml血管內(nèi)皮生長因子的杜氏培養(yǎng)液，然后使用2.5 g/L的胰酶消化貼壁細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮于杜氏培養(yǎng)液中。將含1×105個懸浮細(xì)胞的杜氏培養(yǎng)液500 μl注入上室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后去除濾膜上的未遷移細(xì)胞，然后使用甲醇進(jìn)行固定，Giemsa 溶液進(jìn)行染色，在400倍顯微鏡鏡下隨機選3個視野對遷移細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取平均值。

1.2.5EPCs增殖能力檢測 EPCs培養(yǎng)7 d后，首先使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮于杜氏培養(yǎng)液中，然后將細(xì)胞接種到使用人纖維連接蛋白包被的96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板上每孔加入10 μl噻唑藍(lán)(5 g/L)。經(jīng)過4 h的培養(yǎng)后，首先去除上清液，然后在培養(yǎng)板上每孔加入150 μl二甲基亞砜，充分搖勻，10 min后使用酶標(biāo)儀下在波長490 nm處檢測吸光度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗，χ2檢驗，直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1EPCs鑒定 DiL-acLDL(紅色)和FITC-UEA-1(綠色)染色雙陽性細(xì)胞鑒定為EPCs。見圖1。

2.2兩組治療后Hcy水平，EPCs數(shù)量、增殖、遷移能力以及FMD比較 與對照組比較，治療組EPCs數(shù)量、遷移及增殖能力及FMD顯著增高，Hcy水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3EPCs數(shù)量、遷移、增殖能力與內(nèi)皮舒張功能與Hcy水平的相關(guān)性 葉酸治療8 w后，EPCs數(shù)量、遷移、增殖能力與Hcy水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.668,P<0.05;r=-0.657,P<0.05;r=-0.775,P<0.05)，F(xiàn)MD水平與Hcy水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.718，P<0.05)。

DiI-acLDL(紅色)

FITC-UEA-1(綠色)

雙染色陽性細(xì)胞

表2 兩組治療后Hcy水平和EPCs數(shù)量、增殖、遷移能力及FMD比較

與對照組同時點比較:1)P<0.05

3 討 論

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者中，EPCs數(shù)量明顯降低，且患者的內(nèi)皮功能與EPCs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)〔4〕。EPCs數(shù)量及功能下降與多種因素有關(guān)，在中國老年患者中較為常見的高Hcy血癥在當(dāng)中發(fā)揮了重要作用。Veeranna等〔5〕發(fā)現(xiàn)，高Hcy血癥可抑制EPCs的增殖、遷移和存活，延緩血管內(nèi)皮的修復(fù)，與動脈粥樣硬化相關(guān)；Huang等〔2〕的研究也發(fā)現(xiàn)冠心病患者的EPCs與Hcy水平相關(guān)。年齡是影響Hcy水平的一個重要因素，可能的原因包括老年人群的食欲普遍減退，消化系統(tǒng)功能較年輕時有所下降，導(dǎo)致葉酸等營養(yǎng)素攝入減少；同時，體內(nèi)與Hcy代謝相關(guān)的酶活性下降，導(dǎo)致Hcy難以降解；此外，腎功能下降導(dǎo)致Hcy排泄減少亦可導(dǎo)致Hcy在體內(nèi)的水平升高。目前已知補充葉酸是降低體內(nèi)Hcy的安全和有效的方法。本研究可以證實，老年冠心病患者口服葉酸可改善外周血EPCs的數(shù)量及功能，與此同時患者的Hcy水平明顯下降，由此可以推測，EPC的數(shù)量與功能改善可能與Hcy水平降低有關(guān)。

此外，葉酸對內(nèi)皮功能的保護(hù)也可能與其他因素有關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，葉酸可通過降低氧化應(yīng)激改善冠心病患者的內(nèi)皮功能，且這種作用并不依賴于Hcy的降低〔6〕。四氫生物蝶呤是內(nèi)皮型一氧化氮合酶的必要的輔助因子，四氫生物蝶呤缺乏導(dǎo)致一氧化氮合酶脫耦聯(lián)，氧化應(yīng)激的激活可損害血管的內(nèi)皮功能，同時促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。葉酸是四氧生物蝶呤系類似物，并有抗氧化的作用。外源性補充葉酸可以通過提高四氫生物蝶呤的水平、抗氧化應(yīng)激等途徑改善內(nèi)皮功能，阻斷動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，這種作用獨立于其對Hcy水平的影響。

另外，也可能存在葉酸與冠心病二級預(yù)防藥物的協(xié)同效應(yīng)，調(diào)脂藥物如他汀類藥物〔7〕可導(dǎo)致EPC數(shù)量及活性增加?？傊?，內(nèi)皮功能障礙的本質(zhì)是內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間的動態(tài)平衡的破壞，EPCs在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定狀態(tài)中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，葉酸可以改善老年性冠心病患者外周血EPCs的數(shù)量及其活性，從而為臨床補充葉酸改善血管內(nèi)皮功能提供了一定的理論依據(jù)。本研究也存在不足，如缺乏遠(yuǎn)期臨床預(yù)后的數(shù)據(jù)，研究結(jié)果的臨床意義有待進(jìn)一步明確。葉酸價格低廉，口服方便，無明顯副作用，尤其適合老年患者。因此，補充葉酸對治療老年冠心病無疑很有前景。

1Ali ZA，Rinza R，Douglas G，etal.Tetrahydrobiopterin determines vascular remodeling through enhanced endothelial cell survival and regeneration〔J〕.Circulation，2013；10：S50-8.

2Huang C，Zhang L，Pan H，etal.Endothelial progenitor cells are associated with homocysteine in coronary artery disease〔J〕.Acta Cardiol，2011；66(6)：773-7.

3Anderson CA，Jee SH，Charleston J，etal.Effects of folic acid supplementation on serum folate and plasma homocysteine concentrations in older adults：a dose-response trial〔J〕.Am J Epidemiol，2010；172(8)：932-41.

4涂 昌，蘭 軍，粱逸仙，等.藥物洗脫支架對老年性急性冠狀動脈綜合征患者內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2012；14(9)：918-20.

5Veeranna T，Zalawadiya SK，Niraj A，etal.Homocysteine and reclassification of cardiovascular disease risk〔J〕.J Am Coll Cardiol，2011；58(10)：1025-33.

6程 飛，潘偉彪，蘭 軍，等.口服葉酸輔助治療冠心病的臨床研究〔J〕.中國動脈硬化雜志，2014；22(5)：498-501.

7Bao XM，Wu CF，Lu GP，etal.Atorvastatin inhibits homocysteine-induced dysfunction and apoptosis in endothelial progenitor cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010；31(4)：476-84.

〔2016-05-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(No.A2011722)；廣東省科技廳社會引導(dǎo)發(fā)展項目(No.2011B031800011)

涂 昌(1973-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事冠心病基礎(chǔ)與臨床研究。

陳杰民(1979-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病的介入診療研究。

R543.3

A

1005-9202(2017)17-4216-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.022

1 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科