侯艷香

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，山西 汾陽 032200)

白細(xì)胞介素-21和Blimp1 mRNA在老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞的表達(dá)及作用機(jī)制

侯艷香

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，山西 汾陽 032200)

目的探討白細(xì)胞介素(IL)-21和Blimp1 mRNA在老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)的表達(dá)及作用機(jī)制。方法老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者62例，同期體檢的健康老年人45名作為對照。取外周靜脈血分離PBMC和血漿，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測血漿中IL-21水平，分析DAS28、抗CCP抗體與IL-21的相關(guān)性；實(shí)時熒光定量PCR檢測患者PBMCs中Blimp1 mRNA表達(dá)量；使用IL-21、CD40L刺激PBMCs 72 h后檢測Blimp1 mRNA表達(dá)量，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組CD138+細(xì)胞比例。結(jié)果類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血漿IL-21含量明顯高于對照組(P<0.01)。血漿IL-21含量與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者DAS28、抗CCP抗體具有明顯相關(guān)性(r=0.769、0.785，P<0.05)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)。IL-21、CD40L體外刺激后，對照組與CD40L組Blimp1 mRNA表達(dá)水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；IL-21組、IL-21+CD40L組Blimp1 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.01)；IL-21+CD40L組明顯高于IL-21組(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)顯示，IL-21+CD40L組CD138+細(xì)胞比例明顯高于CD40L組和IL-21組(P<0.05)。結(jié)論IL-21可促進(jìn)老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表達(dá)，IL-21與CD40L協(xié)同作用可通過調(diào)節(jié)Blimp1 mRNA表達(dá)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化并參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素-21；Blimp1

老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者多合并心肺等基礎(chǔ)疾病，病情進(jìn)展迅速且易反復(fù)，治療難度大〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(IL)-21可能通過JAK-STAT通路誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞〔2〕，但是否存在其他調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。Blimp1可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞分化和漿細(xì)胞分泌免疫球蛋白，其在自身免疫方面作用研究較少。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于自身免疫性疾病，存在類風(fēng)濕因子、抗CCP抗體異常升高等B淋巴細(xì)胞相關(guān)異常改變〔3〕。目前關(guān)于風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)Blimp1表達(dá)情況和IL-21的調(diào)節(jié)作用仍鮮有報道，本研究旨在分析老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)Blimp1和IL-21的表達(dá)情況及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年6月醫(yī)院收治確診為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的老年患者62例，其中男17例，女45例；年齡60～75歲，平均(67.31±6.08)歲；關(guān)節(jié)活動指數(shù)為(4±1)，處于風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中度活動期；給予口服甲氨蝶呤15 mg/w與鹽酸潑尼松片10 mg/d聯(lián)合治療。選擇同期在本院體檢的健康老年人45名為對照組，其中男38名，女7名；年齡60～78歲，平均(68.15±7.20)歲。入選受試者采血前未使用抗凝劑，采集的空腹肘靜脈血經(jīng)抗凝處理后無明顯溶血，兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要試劑與儀器 人外周血淋巴細(xì)胞分離液(上海朗頓生物科技有限公司)，RT-PCR試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，Trizol試劑(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)，CD40L、CD20PE、CD138PE抗體(南京森貝伽生物科技有限公司)。羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀，貝克曼Quanta SC流式細(xì)胞儀。

1.3方法

1.3.1血漿IL-21水平檢測 采用ELISA法檢測，將100 μl血漿和各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入96孔板，每孔加入100 μl的酶標(biāo)志物，放入37℃保溫箱中反應(yīng)60 min，甩去孔內(nèi)液體，磷酸緩沖液洗滌后晾干，加顯色液A和B，振蕩混勻后放入暗室中反應(yīng)20 min，加終止液，放入酶標(biāo)儀讀取450 nm波長處每孔的吸光度值。

1.3.2實(shí)時熒光定量PCR檢測 提取兩組外周單個核細(xì)胞(PBMCs)總RNA，檢測純度符合反轉(zhuǎn)錄要求后合成cDNA；實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)總Blimp1 mRNA表達(dá)量，反應(yīng)體系20 μl(cDNA 2 μl，上游引物、下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶10 μl，蒸餾水6 μl)。常規(guī)反應(yīng)條件下共40個循環(huán)，以健康老年人為對照計算類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者mRNA相對表達(dá)量。

1.3.3類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMCs培養(yǎng)及Blimp1 mRNA表達(dá)檢測 將分離的PBMCs用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整密度為1×106/ml并加入96孔板，每孔200 μl，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)孔中是否加IL-21、CD40L將PBMCs分為空白對照組、IL-21組(200 ng/ml)、CD40L組(5 μg/ml)、IL-21+CD40L組，均孵育48 h，Trizol法提取細(xì)胞總RNA并測定其濃度，吸光度值1.8～2.0，放入超低溫冰箱中凍存。熒光定量PCR測定IL-21刺激對Blimp1 mRNA表達(dá)的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-21+CD40L刺激后PBMCs培養(yǎng)72 h后細(xì)胞中CD138+細(xì)胞的比例，使用FlowJo 7.6軟件分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組IL-21含量比較 觀察組IL-21含量為(129.62±9.48)ng/L，明顯高于對照組的(26.57±5.85)ng/L(P<0.01)。血漿IL-21含量與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者DAS28、抗CCP抗體具有明顯相關(guān)性(r=0.769、0.785，P<0.05)。見圖1。

圖1 IL-21與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者DAS28、抗CCP抗體的相關(guān)性

2.2兩組PBMCs中Blimp1 mRNA表達(dá)情況 觀察組PBMCs中Blimp1 mRNA表達(dá)量(1.43±0.22)明顯高于對照組(1.00±0.00)(P<0.05)。

2.3IL-21、CD40L刺激對PBMCs中Blimp1 mRNA表達(dá)的影響 對照組、CD40L組、IL-21組、IL-21+CD40L組的Blimp1 mRNA表達(dá)量分別(1.00±0.00)、(1.03±0.05)、(1.19±0.03)、(1.26±0.05)，4組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中對照組與CD40L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；IL-21組、IL-21+CD40L組明顯高于對照組(P<0.01)；IL-21+CD40L組明顯高于IL-21組(P<0.05)。

2.4IL-21、CD40L刺激對PBMCs中CD138+細(xì)胞比例的影響 CD40L組、IL-21組、IL-21+CD40L組CD138+細(xì)胞比例分別為(0.58±0.22)、(0.76±0.24)、(0.92±0.28)，其中IL-21+CD40L組明顯高于CD40L組和IL-21組(P<0.05)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制除T淋巴細(xì)胞活化外還與B淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)相關(guān)，B淋巴細(xì)胞可通過抗原傳遞、分泌細(xì)胞因子、產(chǎn)生自身抗體等途徑在促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)展〔4〕。目前B淋巴細(xì)胞清除療法已在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中取得較好的療效。細(xì)胞因子可在淋巴細(xì)胞活化、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)方面起到重要作用，也參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜炎性病變過程〔5〕。盡管目前靶向淋巴細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子共刺激等治療手段快速發(fā)展，但療效仍不理想，同時較嚴(yán)重的不良反應(yīng)更是嚴(yán)重影響老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的預(yù)后。

IL-21可與IL-21R結(jié)合后對機(jī)體免疫系統(tǒng)中多種細(xì)胞增殖、分化、功能成熟發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究顯示，IL-21可有效促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD4+T細(xì)胞活化和破骨細(xì)胞生成，發(fā)揮骨折破壞、刺激滑膜中金屬蛋白酶釋放的作用，參與關(guān)節(jié)病變的進(jìn)展〔6〕，阻斷IL-21有望成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的新途徑。在CD40刺激下IL-21可刺激B淋巴細(xì)胞快速增殖、漿細(xì)胞分化，Blimp1基因是漿細(xì)胞分化的重要調(diào)控子，是漿細(xì)胞生成和維持的重要條件，有研究發(fā)現(xiàn)，Blimp1基因異常表達(dá)可促使B細(xì)胞系分化為漿細(xì)胞〔7〕。CD138是漿細(xì)胞中特異性抗原，可作為成熟漿細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，CD138+細(xì)胞比例增加提示漿細(xì)胞數(shù)增加與Blimp1基因高表達(dá)。

1Chu Y，Wang F，Zhou M,etal.A preliminary study on the characterization of follicular helper T (Tfh) cells in rheumatoid arthritis synovium〔J〕.Acta Histochemica，2014；116(3)：539-43.

2孫 波，宋玉國，王 華，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中IL-17的定量檢測〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2014；15(5)：620-2.

3林錦驃.Cyr61在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥微環(huán)境中的作用及其調(diào)控機(jī)制〔D〕.上海：上海交通大學(xué)，2013.

4Huang QQ，Pope RM.The role of glycoprotein 96 in the persistent inflammation of rheumatoid arthritis〔J〕.Arch Biochem Biophys，2013；530(1)：1-6.

5Lee SS，Xin XH，Lee WP,etal.The feasibility of using SMS as a health survey tool：an exploratory study in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Int J Med Inform，2013；82(5)：427-34.

6吳昌順.Furin和PCSK6對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞生物學(xué)功能的影響〔D〕.濟(jì)南：山東大學(xué)，2015.

7Gabriel D，Lange N，Chobaz-Peclat V，etal.Thrombin-sensitive dual fluores imaging and therapeutic agent for detection and treatment of synovial inflammation in murine rheumatoid arthritis〔J〕.J Control Release，2012；163(2)：178-86.

〔2016-10-18修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

侯艷香(1977-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)及血液檢驗(yàn)研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)17-4209-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.018