趙 璇 紀(jì)偉英

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)，湖北 武漢 430100)

VEGFR-2分子探針超聲分子成像評(píng)價(jià)小鼠下肢缺血性血管新生的可行性

趙 璇 紀(jì)偉英

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)，湖北 武漢 430100)

目的探討血管內(nèi)皮細(xì)生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-2分子探針的超聲分子成像評(píng)價(jià)小鼠下肢缺血性血管新生可行性。方法將10只實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后結(jié)扎一側(cè)下肢股動(dòng)脈制備下肢缺血模型，術(shù)后第7天，所有小鼠隨機(jī)經(jīng)尾靜脈注入攜抗小鼠VEGFR-2靶向微泡(MbVEGFR-2)和攜同型抗體對(duì)照微泡(Mbc)，并行超聲分子檢查，測(cè)量雙下肢的顯影強(qiáng)度(VI)值，并處死小鼠后對(duì)骨骼肌進(jìn)行免疫組化檢查。結(jié)果經(jīng)過(guò)8 min循環(huán)時(shí)間后，MbVEGFR-2組小鼠可見(jiàn)明顯的超聲顯影，Mbc組小鼠可見(jiàn)輕度超聲顯影，但其顯影強(qiáng)度明顯弱于MbVEGFR-2組；在非缺血小鼠下肢，經(jīng)過(guò)8 min循環(huán)時(shí)間后，MbVEGFR-2組和Mbc組小鼠均未見(jiàn)明顯的超聲顯影；缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠MbVEGFR-2的VI值明顯高于Mbc和非缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠(P<0.01)，缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠Mbc的VI值高于非缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠(P<0.05)，非缺血下肢骨骼肌VI值在MbVEGFR-2和Mbc之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DAB染色結(jié)果顯示下肢缺血小鼠骨骼肌血管有VEGFR-2表達(dá)，而下肢非缺血小鼠骨骼肌血管中未見(jiàn)VEGFR-2表達(dá)。結(jié)論采用攜VEGFR-2分子探針的超聲成像對(duì)缺血下肢新血管進(jìn)行造影可行，為評(píng)價(jià)缺血性血管新生提供了病理學(xué)依據(jù)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2；超聲；分子成像；血管新生

血管新生是缺血性疾病血管阻塞后改善機(jī)體自身恢復(fù)血流灌溉的重要機(jī)制〔1〕，通過(guò)無(wú)創(chuàng)的分子影像技術(shù)對(duì)新生血管的早期有效評(píng)價(jià)對(duì)于指導(dǎo)臨床缺血性心血管疾病的治療及療效評(píng)價(jià)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-2作為分子靶點(diǎn)的超聲分子顯影技術(shù)已在評(píng)價(jià)腫瘤組織血管新生領(lǐng)域得到成功應(yīng)用〔2〕，但利用VEGFR-2分子探針的超聲顯影技術(shù)在評(píng)價(jià)缺血性血管新生方面鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)建立小鼠下肢缺血模型，探討利用VEGFR-2分子探針的超聲分子成像評(píng)價(jià)小鼠下肢缺血性血管新生的可行性。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明雌性小鼠(清潔級(jí))10只，10周齡，20～30 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證批號(hào)：scXK(粵)2016-015。主要實(shí)驗(yàn)儀器：Sequoia 512 超聲心動(dòng)圖儀(Siemens，德國(guó))，DAKO Evision免疫組化顯色系統(tǒng)和(DAKO，丹麥)。主要實(shí)驗(yàn)試劑：二棕櫚酰磷脂酰單件(DPPC，Sigma，美國(guó))，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin，Avanti，美國(guó))，聚乙二醇(PEG，Applichem，德國(guó))，鏈親和素(Streptavidin，Sigma，美國(guó))，普羅沙姆-188(Poloxamer188，BASF，德國(guó))，純化的大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體(Purified Rat Anti-Mouse VEGFR-2，EB，美國(guó))，生物素化的大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體(Biotin Rat Anti-Mouse VEGFR-2，EB，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1VEGFR-2靶向微泡(MbVEGFR-2)和攜同型抗體對(duì)照微泡(Mbc)的制備 將DPPC、DSPE-PEG2000-Biotin、PEG等脂質(zhì)材料按照事先確定的比例溶解于一定量的蒸餾水中，同時(shí)通入全氟丙烷(C3F8)氣體，通過(guò)超聲振蕩形成白色液體得到生物化的脂質(zhì)微泡。然后將生物化的脂質(zhì)微泡靜置并棄除下清液中純化的微泡，加入Streptavidin和Purified Rat Anti-Mouse VEGFR-2或同型抗體，制備成攜Purified Rat Anti-MouseMbVEGFR-2和Mbc。

1.2.2動(dòng)物準(zhǔn)備 將10只小鼠采用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，于雙下肢及腹股溝區(qū)域備皮，切開(kāi)腹股溝區(qū)域皮膚，分離出股動(dòng)脈及其分支，結(jié)扎并剪斷股動(dòng)脈及其分支，通過(guò)肉眼觀察到下肢皮膚發(fā)生明顯變化時(shí)，方可縫合手術(shù)切口。

1.2.3超聲分子成像 將小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，然后四肢固定于鼠板上。尾靜脈插留置針用于微泡注射，置自制水囊于小鼠雙側(cè)下肢上，用自制支架固定超聲探頭(17L5)于固定的小鼠雙側(cè)下肢上，不斷調(diào)試探頭位置以獲得良好的下肢顯像并保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不發(fā)生位移。超聲分子成像基于二次諧波成像技術(shù)，儀器的各項(xiàng)參數(shù)：探頭發(fā)射頻率為7.0 MHz，接收頻率為14 MHz，機(jī)械指數(shù)(MI)為0.18，超聲發(fā)射間隔為10 s。超聲分子成像通過(guò)尾靜脈間隔30 min隨機(jī)注射MbVEGFR-2和Mbc(約5×107個(gè))。在循環(huán)時(shí)間達(dá)到8 min后獲取實(shí)驗(yàn)小鼠的第一幀顯影圖像(組織本地和下肢中滯留微泡)，此后連續(xù)超聲發(fā)射3 s以破壞微泡，10 s后再次獲取實(shí)驗(yàn)小鼠第二幀圖像(組織本地)，實(shí)驗(yàn)中所有實(shí)驗(yàn)小鼠的超聲造影圖像存盤，用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.4MCE圖像分析 采用MCE圖像分析軟件(美國(guó)Virginia大學(xué))對(duì)所獲取的超聲圖像進(jìn)行分析，測(cè)量實(shí)驗(yàn)小鼠下肢骨骼肌超聲顯影的聲強(qiáng)度(VI)，并利用彩色編碼技術(shù)制作下肢骨骼肌顯影的彩色編碼圖像，紅色、橙色及白色分別表示顯影強(qiáng)度由弱到強(qiáng)變化。

1.2.5免疫組化 超聲造影結(jié)束后，立刻處死實(shí)驗(yàn)小鼠并取雙側(cè)骨骼肌，4%多聚甲醛固定。制備冰凍切片，嚴(yán)格按照說(shuō)明書孵育抗小鼠VEGFR-2以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊大鼠二抗，后行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素復(fù)染，最后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1超聲分子成像檢查情況 在缺血小鼠下肢，經(jīng)過(guò)8 min循環(huán)時(shí)間后，MbVEGFR-2組小鼠可見(jiàn)明顯的超聲顯影，Mbc組小鼠可見(jiàn)輕度超聲顯影，但其顯影強(qiáng)度明顯弱于MbVEGFR-2組；在非缺血小鼠下肢，經(jīng)過(guò)8 min循環(huán)時(shí)間后，MbVEGFR-2組和Mbc組小鼠均未見(jiàn)明顯的超聲顯影。見(jiàn)圖1。

圖1 缺血和非缺血小鼠下肢超聲分子成像

2.2超聲VI值分析 缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠MbVEGFR-2的VI值〔(22.57±5.42)U〕明顯高于Mbc〔(7.06±1.64)U，P<0.01〕，也明顯高于非缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠〔(4.62±1.18)U,P<0.01〕，缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠Mbc的VI值高于非缺血下肢實(shí)驗(yàn)小鼠〔(4.85±1.23)U,P<0.05〕，非缺血下肢骨骼肌VI值在MbVEGFR-2和Mbc組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3免疫組化結(jié)果 DAB染色結(jié)果顯示下肢缺血小鼠骨骼肌血管有VEGFR-2表達(dá)，棕黃色陽(yáng)性顆粒大量存在，而下肢非缺血小鼠骨骼肌血管中未見(jiàn)VEGFR-2表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠下肢骨骼肌免疫組化DAB染色結(jié)果

3 討 論

隨著人口老齡化的加劇，老年人下肢缺血的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)〔3〕。下肢缺血是由動(dòng)脈硬化閉塞和血管閉塞性脈管炎引起的，屬于常見(jiàn)的血管疾病。當(dāng)組織出現(xiàn)缺血缺氧時(shí)，機(jī)體可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子作用于缺血區(qū)域，例如腫瘤壞死因子(TNF)-α、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-2，血管生成素(Angs)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等促進(jìn)形成新血管〔4〕，從而使局部缺血缺氧組織供血狀況得到改善。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的VEGFR-2相結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞管道形成，在心血管形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用〔5〕。

本研究結(jié)果顯示，MbVEGFR-2組小鼠可見(jiàn)明顯的超聲顯影，Mbc組小鼠可見(jiàn)輕度超聲顯影，但其顯影強(qiáng)度明顯弱于組；在非缺血小鼠下肢，經(jīng)過(guò)8 min循環(huán)時(shí)間后，MbVEGFR-2組和Mbc組小鼠均未見(jiàn)明顯的超聲顯影，這主要是由于MbVEGFR-2借助于攜帶的VEGFR-2抗體與下肢缺血處新生血管內(nèi)皮VEGFR-2相結(jié)合，從而在超聲檢查時(shí)出現(xiàn)明顯的靶向超聲顯影，而Mbc攜帶的同型抗體因無(wú)法與新生血管內(nèi)皮VEGFR-2結(jié)合而未出現(xiàn)明顯的超聲顯影〔6〕。在本次研究中Mbc小鼠缺血下肢VI值高于非缺血下肢的VI值，這可能與微泡在新生血管中有一定程度的滯留有關(guān)，其可能機(jī)制是小鼠下肢缺血的第7天，局部組織處于炎癥反應(yīng)中，脂質(zhì)微泡可能通過(guò)血清補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理作用及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)微泡的“非免疫球蛋白依賴的吞噬作用”，使微泡長(zhǎng)時(shí)間(30 min)保持完整，從而產(chǎn)生一定程度的“被動(dòng)靶向顯影”〔7〕。本研究通過(guò)結(jié)扎小鼠下肢股動(dòng)脈制備下肢缺血缺氧模型，并采用攜VEGFR-2分子探針的超聲成像對(duì)缺血下肢新血管進(jìn)行造影，此方法可行，并為評(píng)價(jià)缺血性血管新生提供了病理學(xué)依據(jù)。

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〔2017-01-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

紀(jì)偉英(1962-)，女，主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科超聲研究。

趙 璇(1982-)，女，住院醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科超聲研究。

R39

A

1005-9202(2017)17-4204-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.015