王 彥 岳天孚

(天津市靜海縣醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 301600)

siRNA靶向沉默hTERT基因?qū)m頸癌Caski細(xì)胞特性的影響

王 彥 岳天孚1

(天津市靜?？h醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 301600)

目的研究siRNA靶向沉默hTERT基因后對宮頸癌Caski細(xì)胞特性的影響。方法設(shè)計(jì)、合成特異性針對hTERT mRNA的siRNA，將其克隆入pGenesil-1.1質(zhì)粒中，重組成hTERT mRNA-siRNA的表達(dá)載體，導(dǎo)致目的基因沉默，是由電轉(zhuǎn)染入宮頸癌Caski細(xì)胞，從而產(chǎn)生RNA干擾作用。應(yīng)用Western印跡法及RT-PCR法檢測沉默hTERT基因后對于宮頸癌Caski細(xì)胞的蛋白及mRNA的表達(dá)情況；檢測細(xì)胞周期運(yùn)用流式細(xì)胞儀；沉默hTERT基因后宮頸癌Caski細(xì)胞的增殖能力可通過CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)檢測。沉默hTERT基因后宮頸癌Caski細(xì)胞的侵襲能力可通過小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測。結(jié)果hTERT基因沉默48 h以后，與空白組及未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組宮頸癌Caski細(xì)胞的蛋白及mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)；細(xì)胞周期的檢測結(jié)果顯示S期的細(xì)胞數(shù)目明顯減低，轉(zhuǎn)染組的宮頸癌Caski細(xì)胞停留于G0/G1周期，空白組、轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組相比差異顯著(P<0.05)；宮頸癌Caski細(xì)胞在轉(zhuǎn)染組的增殖過程中被明顯抑制(P<0.05)；轉(zhuǎn)染組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。結(jié)論Si RNA靶向沉默hTERT基因電轉(zhuǎn)染后，使宮頸癌Caski細(xì)胞的增殖和遷移能力得到抑制，一定程度上改善了宮頸癌患者的預(yù)后。

宮頸癌；hTERT基因；基因沉默；Caski細(xì)胞特性；RNA干擾

宮頸癌的發(fā)病率與病死率位居女性惡性腫瘤的第二位〔1～3〕。我國統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)已占全球的14.3‰，大約每年有3.4萬名婦女因患宮頸癌死亡〔4，5〕。目前，臨床上對于宮頸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、侵襲及預(yù)后不良等問題還尚未有好的方法。近些年來隨著干細(xì)胞移植及基因技術(shù)的發(fā)展，為宮頸癌的有效預(yù)防和治療帶來新的希望〔6～8〕。hTERT基因是非常重要的一種營養(yǎng)因子，對于原發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)高表達(dá)〔9〕，但是對于正常組織中并無表達(dá)，故具有重要的臨床價(jià)值和多重生物學(xué)效應(yīng)。本研究采用沉默hTERT基因后電轉(zhuǎn)染入宮頸癌Caski細(xì)胞中，探討此法對宮頸癌治療的有效性。

1 材料和方法

1.1主要材料 由天津醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)人宮頸癌Caski細(xì)胞。DMEM培養(yǎng)液由美國Becon Dickinson公司生產(chǎn)，胎牛血清由美國Abcam公司生產(chǎn)，0.25%胰酶、Ⅱ膠原酶由Sigma公司生產(chǎn)，RT-PCR兩步法試劑盒、mRNA提取試劑盒由杭州吉諾公司生產(chǎn)，端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶由本元正陽基因技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)，siRNA鏈由美國HyClone公司生產(chǎn)，兔抗人hTERT多克隆抗體、β-actin兔抗鼠多克隆抗體和兔抗鼠MBP抗體由美國New Jersey公司生產(chǎn)，β-actin引物由上海Excell生物工程公司合成生產(chǎn)，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由美國Sigma公司生產(chǎn)，Western試劑盒是美國Promega公司產(chǎn)品，Western印跡凝膠成像儀由FUJIFILM Corporation生產(chǎn)。

1.2設(shè)計(jì)合成及轉(zhuǎn)染hTERT的siRNA序列 設(shè)計(jì)hTERT siRNA引物(根據(jù)參考文獻(xiàn)〔10〕)序列為：上游引物：5′-CTGAAGTGTCACAGCCTGTTT-3′，下游引物：5′-CACACATGCGTGAAACCTGTA-3′，產(chǎn)物大小：111 bp；β-actin上游引物：5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，下游引物：5′-CTCAGCCTTGACTGTGCC-3′，產(chǎn)物大小：151 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火36 s，72℃延伸30 s，36個(gè)周期循環(huán)后，72℃延伸6 min。于4℃下保存產(chǎn)物。PCR反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行3次。取5 ml PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用β-actin作為內(nèi)參照。放置GDSS000凝膠自動(dòng)成像儀上拍照并保存，應(yīng)用Image-Pro Plus8.0軟件對于β-actin條帶與hTERT的條帶灰度的相對比值進(jìn)行mRNA半定量分析。DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)宮頸癌Caski細(xì)胞，培養(yǎng)基中含10%小牛血清。5%CO2的飽和濕度培育箱中培育，置于37℃下恒溫密閉式。每2天傳代一次，把處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗并由胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液離心收集Caski，用電穿孔緩沖液重懸，離心，靜置5 min，清洗細(xì)胞3次，離心，重懸于電轉(zhuǎn)液中，移至電擊杯，加入并混勻20 μg的質(zhì)粒DNA，置于冰上30 min后，以電壓350 V/cm，電容25 μF，時(shí)間常數(shù)T為0.9 ms的電轉(zhuǎn)化參數(shù)，進(jìn)行電穿孔。把轉(zhuǎn)染后的hTERT-Caski細(xì)胞，室溫放置30 min，細(xì)胞移入含10%小牛血清，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃恒溫孵箱內(nèi)培育。進(jìn)行電轉(zhuǎn)染時(shí)分為3組：電轉(zhuǎn)染hTERT-siRNA載體者為Caski/hTERT-siRNA組(轉(zhuǎn)染組)；轉(zhuǎn)染NC siRNA載體者為Caski/control組(對照組)，未轉(zhuǎn)染的宮頸癌Caski細(xì)胞為Caski組(空白組)，并于轉(zhuǎn)染48 h后行RNA干擾效應(yīng)的檢測。

1.3RT-PCR檢測沉默hTERT mRNA的表達(dá) 把處于對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞Caski，接種在10 cm2培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2，濕度飽和的培養(yǎng)箱至90%左右，運(yùn)用cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；運(yùn)用TRIzol法提取總RNA。將產(chǎn)物cDNA反應(yīng)結(jié)束后作為PCR反應(yīng)模板，放置于-20℃冰箱中保存。設(shè)計(jì)特異性hTERT基因序列引物，hTERT和內(nèi)參β-actin引物序列：上游引物：5′-CTGAAGTGTCACAGCCTGTTT-3′，下游引物：5′-CACACATGCGTGAAACCTGTA-3′，產(chǎn)物大?。?11 bp；β-actin上游引物：5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，下游引物：5′-CTCAGCCTTGACTGTGCC-3′，產(chǎn)物大小：151 bp。待調(diào)制好PCR反應(yīng)液后，設(shè)置PCR儀反應(yīng)參數(shù)為：94℃變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火36 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35個(gè)周期后，終末延伸72℃、6 min。并于4℃下保存產(chǎn)物。PCR每一反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行3次。取5 ml PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(152 V，90 min)。穩(wěn)壓100 V電泳30 min后觀察結(jié)果，運(yùn)用GDSS000凝膠自動(dòng)成像儀電泳后顯像并拍照保存，判定擴(kuò)增帶位于陽性擴(kuò)增帶的標(biāo)本為陽性，用hTERT/β-actin 代表hTERT mRNA的相對表達(dá)量。

1.4Westem印跡檢測沉默hTERT蛋白的表達(dá) 將宮頸癌Caski細(xì)胞胰酶消化后收集保存，棄掉培養(yǎng)液后沖洗3次，進(jìn)行總蛋白的提取，采用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，吸取50 μg總蛋白。設(shè)置60 V電壓開始電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)移以40 V、150 min的轉(zhuǎn)印條件下印跡到PVDF膜上，取出PVDF膜浸后泡入5%脫脂奶粉的FIBS液中封閉，37℃下孵育2 h。一抗孵育：加入hTERT多克隆一抗，稀釋濃度1∶1 000，4℃過夜，洗膜5次，5 min/次，二抗孵育：加入HRP標(biāo)記的GAPDH和二抗，稀釋濃度1∶5 000，37℃下孵育2 h，PBS洗滌后運(yùn)用ECL法檢測。暗室曝光X 光片，通過GDSS000凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)攝像，漂洗并干燥后避光保存圖片。Image-Pro Plus8.0 軟件分析條帶灰度值，以h TERT/GAPDH代表代表hTERT的相對表達(dá)量。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化 將以上三組Caski細(xì)胞收集，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106L-1，冷PBS清洗兩遍后，用70%的冷乙醇(4℃)將細(xì)胞沉淀后混勻備用，細(xì)胞洗滌后再調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106L-1(用PBS)與含50 μg/ml RNA 酶的Tris-Hcl緩沖液(pH7.4) 共同孵育30 min。用100 μg/ml碘化丙啶(PI)對細(xì)胞DNA染色，暗室中放置1 h，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量及分布，并計(jì)算各周期細(xì)胞所占百分比。

1.6小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Caski細(xì)胞侵襲能力 將Caski細(xì)胞種于Transwell小室的上室，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠。在聚碳酸酯微孔濾膜上以50 μg/孔鋪Matrigel，在Transwell小室下室中加入胎牛血清作為條件培養(yǎng)液。體積分?jǐn)?shù)為10%。把處理過的Caski細(xì)胞懸液100 μl(3×105/L)，溶膠后置于4℃下培養(yǎng)24 h；PBS漂洗3遍，重懸細(xì)胞，獲取消化后的細(xì)胞；并于35℃下孵育，觀察細(xì)胞遷移結(jié)果并進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)，用蘇木精染色10 min，以PBS沖洗小室，將上室的聚碳酸酯濾膜待自然風(fēng)干后沿邊緣小心取下，并固定于載玻片上，固定時(shí)膜外面朝下，封片后進(jìn)行干燥，200×光鏡下每膜直徑上分別于左、右、上、下、中計(jì)數(shù)5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算出其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)定3個(gè)平行小室。

1.7CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測Caski細(xì)胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染后各組處于對數(shù)生長期Caski細(xì)胞收集，胰酶消化后采用有血清培養(yǎng)皿配制成的單細(xì)胞懸液。以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中，并在每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培育24 h后，于轉(zhuǎn)染后1～4 d，每天各取96孔板經(jīng)CCK-8試劑室溫融化，每孔里加入CCK-8 20 μl，Caski細(xì)胞的增殖情況以CCK-8法檢測。培養(yǎng)基溫育4 h后，以只加CCK-8溶液和培養(yǎng)液不加細(xì)胞空白孔對比，其他實(shí)驗(yàn)步驟均相同。每孔的光吸光度OD值采用酶聯(lián)免疫檢測并記錄結(jié)果，其參考波長為630 nm，波長為450 nm，第2～4天后重復(fù)以上的操作。并將各組的細(xì)胞生長及影響繪制曲線圖。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，q檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR檢測沉默hTERT mRNA的表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示，hTERT mRNA的表達(dá)在轉(zhuǎn)染組(Caski/hTERT-siRNA組)的條帶呈明顯變窄，轉(zhuǎn)染組(0.48±0.05)與未轉(zhuǎn)染組(0.82±0.10)和空白組(0.86±0.08)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測Caski細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)

2.2Western印跡檢測沉默hTERT蛋白的表達(dá) hTERT蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染組的條帶明顯變窄，轉(zhuǎn)染組(0.74±0.06)與未轉(zhuǎn)染組(0.92±0.09)和空白組(0.97±0.02)的灰度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測Caski細(xì)胞中hTERT蛋白的表達(dá)

2.3細(xì)胞周期檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組和空白組比較，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增大，S期細(xì)胞明顯降低(均P<0.05)，G2/M期Caski細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明S期細(xì)胞受到明顯阻滯。見表1。

表1 siRNA抑制hTERT表達(dá)對Caski細(xì)胞周期的影響

與轉(zhuǎn)染組比較：1)P<0.05，下表同

2.4小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 未轉(zhuǎn)染組和空白組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量分別為(45.01±0.02)%和(44.06±0.08)%；轉(zhuǎn)染組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量較未轉(zhuǎn)染組與空白組明顯下降〔(25.03±0.23)%，P<0.05〕。見圖3。

2.5CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 與空白組和未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組Caski細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(P<0.05)，見表2。

圖3 各組穿過濾膜細(xì)胞(×200)

表2 hTERT siRNA對Caski細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，放、化療可因正常組織的可耐受性而受到限制，進(jìn)而影響宮頸癌生存率的提高。目前，基因治療腫瘤是實(shí)驗(yàn)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)問題，國內(nèi)外研究表明，新型基因作為宮頸癌的治療手段之一，為其開辟了一條新的治療方向〔11，12〕。近年來新發(fā)展的RNAi是一項(xiàng)沉默基因技術(shù)，siRNA的基因特異性更高。臨床研究中將建立的兩個(gè)表達(dá)HPV16 E6 siRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對照質(zhì)粒，成功轉(zhuǎn)染到宮頸癌Caski細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率能夠達(dá)到50%以上，表明轉(zhuǎn)染 E6 siRNA 質(zhì)粒能使E6 mRNA 的表達(dá)明顯下降〔13〕，本研究將hTERT mRNA-siRNA克隆入pGenesil-1.1質(zhì)粒中，重組成hTERT mRNA-siRNA的表達(dá)載體，通過RT-PCR檢測得知hTERT mRNA的表達(dá)降低，表明目的基因沉默，與成海恩等〔13〕的研究結(jié)果相一致。研究數(shù)據(jù)表明，端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，能夠維持端粒長度，hTERT是端粒酶的催化亞單位〔14〕，是能以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶，hTERT與細(xì)胞生長、發(fā)育和增殖、分化有密切關(guān)聯(lián)，hTERT可以明顯抑制癌細(xì)胞生長，存在多重生物學(xué)效應(yīng)〔15，16〕。hTERT表達(dá)在正常組織中是被抑制的，但在癌細(xì)胞、腫瘤系中卻呈現(xiàn)著高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)hTERT基因經(jīng)電轉(zhuǎn)染可以取得有效而持久的作用〔17～19〕。研究發(fā)現(xiàn)用電穿孔法轉(zhuǎn)染基因的目的基因瞬時(shí)表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，所以電轉(zhuǎn)染法可以作為一個(gè)有效且簡單可行的方法〔4,20,21〕。

本文顯示siRNA靶向沉默hTERT基因電轉(zhuǎn)染入宮頸癌Caski細(xì)胞后，可以對宮頸癌的治療起到積極指導(dǎo)作用，hTERT基因可在宮頸癌及其他腫瘤的基因治療方面提供新的靶點(diǎn)。

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〔2016-08-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

王 彥(1979-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤研究。

R737.33

A

1005-9202(2017)17-4199-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.013

1 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院