王 雪 金 朗 王炳強

(滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理教研室,河北 滄州 061000)

馬錢子堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖與凋亡的影響及相關(guān)機制

王 雪 金 朗1王炳強2

(滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理教研室,河北 滄州 061000)

目的探討馬錢子堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖與凋亡的影響及其分子機制。方法以人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為研究對象，將其按不同處理方式分為空白對照組，馬錢子堿(1 μmol/L)處理組、白細(xì)胞介素(IL)-6(100 μg/L)處理組、馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組。CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況；Annexin-V-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況；細(xì)胞免疫熒光染色檢測p-STAT3蛋白表達(dá)的位置和強度，Western印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量。結(jié)果馬錢子堿處理組、馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組均可明顯抑制細(xì)胞增殖且馬錢子堿處理組細(xì)胞抑制率明顯高于馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組(P<0.05)。馬錢子堿處理組、馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組且馬錢子堿處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組(P<0.05)；IL-6處理組細(xì)胞凋亡率與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。馬錢子堿處理組p-STAT3比值明顯低于空白對照組(P<0.05)；同時馬錢子堿濃度越高p-STAT3蛋白表達(dá)量越低。馬錢子堿處理組p-STAT3和抗凋亡BCL-2蛋白表達(dá)量明顯低于空白對照組，促凋亡蛋白Bax、執(zhí)行凋亡的DNA修復(fù)酶Parp表達(dá)量明顯高于空白對照組(P<0.05)；IL-6處理組的p-STAT3蛋白表達(dá)量明顯高于空白對照組(P<0.05)；馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組BCL-2蛋白表達(dá)量明顯高于馬錢子堿處理組，而Bax和DNA修復(fù)酶Parp表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。結(jié)論馬錢子堿可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖并促進(jìn)凋亡，其主要通過調(diào)節(jié)IL-6/ STAT3信號通路，抑制細(xì)胞中STAT3磷酸化來實現(xiàn)。

馬錢子堿；結(jié)腸癌；細(xì)胞凋亡；IL-6/STAT3通路

結(jié)腸癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率很高〔1〕。馬錢子為馬錢屬植物馬錢的成熟種子，馬錢子堿是其中主要活性成分之一，具有抗菌、抗感染、抑制中樞神經(jīng)等多種藥理學(xué)作用〔2〕，近年來馬錢子堿抗腫瘤作用成為該領(lǐng)域的研究熱點。研究已發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿可有效抑制乳腺癌、肝癌、肺癌細(xì)胞的增殖〔3〕，但具體分子機制仍未明確。本文擬觀察馬錢子堿對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29購于上海羽朵生物科技有限公司；馬錢子堿購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；1640細(xì)胞培養(yǎng)基購于北京萬域美瀾科技有限公司；CCK8試劑盒、Annexin-V-PI-雙染凋亡檢測試劑盒均購于上海玉博生物科技有限公司；p-STAT3、STAT3 、GAPDH 抗體均購于美國BD公司；熒光二抗購于美國Abbkine公司；IL-6、DAPI、ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購于上海研卉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況 設(shè)空白對照組、馬錢子堿(1 μmol/L)處理組、IL-6(100 μg/L)處理組、馬錢子堿聯(lián)合白細(xì)胞介素(IL)-6處理組。取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞按5×103個/孔的密度將細(xì)胞懸液接種到96孔板上，放入5%CO2濃度的孵箱中1 d，棄上清，根據(jù)分組情況加入對應(yīng)的馬錢子堿、IL-6。放入RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育1 d后，各孔滴入20 μl CCK8試劑，培養(yǎng)2 h，讀取450 nm處吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率。用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2Annexin-V-PI雙染法檢測HT-29細(xì)胞凋亡 研究分組同1.2.1，取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞懸液接種到6孔板中，放入5%CO2濃度的孵箱中培養(yǎng)24 h后棄去上清，根據(jù)分組加入馬錢子堿、IL-6，培養(yǎng)24 h后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞3次，按試劑盒說明書加入Annexin-V-FITC、PI，4℃暗室反應(yīng)45 min，加300 μl含Ca2+的緩沖液，均勻混合后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3免疫熒光染色 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按1×108個/孔濃度接種到6孔板中，分為空白對照組、1 μmol/L、4 μmol/L馬錢子堿處理組。培養(yǎng)1 d后用磷酸緩沖液沖洗3次，室溫下用10%多聚甲醛固定40 min，磷酸緩沖液洗滌后加入1 ml 0.1%的Trition溶液，室溫下反應(yīng)30 min，再用磷酸緩沖液洗滌后加5%的BSA封閉60 min。滴加相應(yīng)的一抗，4℃過夜，加熒光二抗(1∶1 000)，室溫下孵育2 h；加DAPI溶液，室溫下暗室放置30 min，磷酸緩沖液洗滌，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4Western印跡檢測 將處理后的細(xì)胞沖洗后加RIPA蛋白裂解液，離心后取上清，測定蛋白濃度，在100 μl SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液中水浴10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，分別滴加STAT3、p-STAT3、GAPDH 抗體，4℃過夜，次日用磷酸緩沖液沖洗后滴加熒光二抗，室溫下?lián)u床放置2 h，洗滌后ECL發(fā)光試劑顯影，暗室中膠片感光。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組對HT-29細(xì)胞增殖的影響 CCK8法檢測顯示，空白對照組、馬錢子堿處理組、IL-6處理組、馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組細(xì)胞增殖抑制率分別為(0.39±0.12)%、(32.80±1.94)%、(3.26±0.83)%、(19.63±2.31)%。馬錢子堿處理組、馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組均可明顯抑制細(xì)胞增殖；馬錢子堿濃度相同時，馬錢子堿處理組的細(xì)胞抑制率明顯高于馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。光鏡下觀察，馬錢子堿處理組細(xì)胞變圓、較多細(xì)胞呈低折光率；馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組細(xì)胞變圓，低折光率細(xì)胞較少。見圖1。

圖1 4組HT-29細(xì)胞經(jīng)處理后形態(tài)變化(×400)

2.2單用馬錢子堿和馬錢子堿聯(lián)合IL-6對HT-29細(xì)胞凋亡的影響 Annexin-V-PI雙染法檢測顯示，空白對照組、馬錢子堿處理組、IL-6處理組、馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組細(xì)胞凋亡率為(2.04±0.67)%、(1.86±0.71)%、(21.37±3.50)%、(14.15±2.81)%。馬錢子堿處理組、馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組，馬錢子堿處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組(P<0.05)；IL-6處理組細(xì)胞凋亡率與空白對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3馬錢子堿對HT-29細(xì)胞中p-STAT3蛋白水平的影響 空白對照組、1 μmol/L、4 μmol/L馬錢子堿處理組p-STAT3蛋白表達(dá)量和總STAT3蛋白表達(dá)量分別為：(98.14±5.37)、(57.26±4.09)、(13.61±2.18)；(38.61±9.10)、(35.39±6.24)、(33.55±6.95)。1、4 μmol/L馬錢子堿處理組p-STAT3比值均明顯低于空白對照組(P<0.05)且馬錢子堿濃度越高p-STAT3蛋白表達(dá)量越低。3組總STAT3蛋白表達(dá)水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；見圖2。免疫熒光顯示：p-STAT3蛋白在空白對照組細(xì)胞中為綠色熒光，多分布于細(xì)胞核中；4 μmol/L馬錢子堿處理組綠色熒光強度明顯弱于空白對照組。

圖2 馬錢子堿對HT-29細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)的抑制作用

2.4IL-6介導(dǎo)的p-STAT3升高對馬錢子堿促進(jìn)HT-29凋亡的影響 1 μmol/L馬錢子堿處理組p-STAT3和抗凋亡BCL-2蛋白表達(dá)量分別為：(16.05±1.90)、(26.81±5.57)明顯低于空白對照組的(30.97±8.11)、(53.18±10.08)，促凋亡蛋白Bax、執(zhí)行凋亡的DNA修復(fù)酶PARP表達(dá)量分別為：(11.59±4.91)、(15.03±2.45)明顯高于空白對照組的(5.27±1.05)、(7.91±1.85)；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。100 μg/L IL-6處理組的p-STAT3蛋白表達(dá)量為(30.91±5.37)明顯高于空白對照組的(18.16±9.21)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。馬錢子堿聯(lián)合IL-6處理組BCL-2蛋白表達(dá)量為(20.51±3.38)明顯高于馬錢子堿處理組的(9.57±5.62)而Bax和DNA修復(fù)酶Parp表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。

3 討 論

馬錢子堿對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用，其可通過影響線粒體去極化和Ca2+濃度來抑制肝癌細(xì)胞HepG2的體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可通過影響相關(guān)信號通路來降低細(xì)胞侵襲力，抑制血管生成。肺癌細(xì)胞體外研究中，馬錢子堿通過抑制NF-Kb和Cox2基因表達(dá)水平來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔4〕。骨髓瘤體外研究中，馬錢子堿可激活JNK信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上研究提示，馬錢子堿可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制血管生成來發(fā)揮抗腫瘤作用〔5〕。

STAT3是IL-6/JAK、SRC、EgfR等多個致癌性信號通路的交接點，該靶點的活化在腫瘤發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。STAT3在卵巢癌、前列腺癌、骨髓瘤等多種癌細(xì)胞中均存在過度表達(dá)〔6〕。STAT3高表達(dá)可激活相關(guān)基因，刺激細(xì)胞分化、增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，表現(xiàn)出致癌作用〔7〕。本次研究顯示，馬錢子堿可降低人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中p-STAT3表達(dá)水平，抑制增殖，促進(jìn)凋亡；同時其還可上調(diào)HT-29細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平，降低抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)水平，增加執(zhí)行凋亡的DNA修復(fù)酶Parp含量，介導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡。同時給予IL-6和馬錢子堿時，由于IL-6能夠維持并激活人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中p-STAT3水平，從而減弱了馬錢子堿抑制HT-29細(xì)胞凋亡的能力。

本實驗通過體外研究明確了馬錢子堿可介導(dǎo)IL-6/ STAT3信號通路，抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中STAT3磷酸化，進(jìn)而減緩細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，起到抑癌作用。

1張海璐，鄧 婷，白 明，等.左右半結(jié)腸癌臨床特點及生存預(yù)后的比較〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(9)：2446-7.

2李仙仙.馬錢子堿對人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的作用研究〔D〕.太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2013.

3Liu P，Zhang X，Xu W，etal.Electrochemical sensor for the determination of brucine in human serum based on molecularly imprinted poly-o-phenylenediamine /SWNTs composite film〔J〕.Sens Actuators B Chem，2012；163(1)：84-9.

4Wang X，Dong H，Yang B.etal.Large-scale separation of strychnine and brucine from Strychnos nux-vomica L.by pH-zone-refining counter-current chromatography〔J〕.J Liquid Chromatography Relat Technol，2013；36 (5/8)：648-57.

5于淑坤.綜合放松訓(xùn)練對結(jié)腸癌圍術(shù)期患者免疫功能的影響〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2014；15(2)：214-7.

6Chen ZP，Xiao L，Liu D.etal.Synthesis of a novel polymer cholesterol-poly(ethylene glycol) 2000-glycyrrhetinic acid (chol-PEG-GA) and its application in brucine liposome〔J〕.J Appl Polymer Sci，2012；124(6)：4554-63.

7Mishra SD，Bose D，Shukla SK,etal.Monitoring strychnine and brucine in biochemical samples using direct injection micellar liquid chromatography〔J〕.Analytical Method，2013；5(7)：1747-54.

〔2016-11-17修回〕

(編輯 郭 菁)

滄州市科技支撐基金項目(131302066)

王 雪(1981-)，女，碩士，講師，主要從事藥理學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4194-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.011

1 滄州市人民醫(yī)院藥學(xué)部 2 滄州市婦幼保健院藥劑科