呂錫芳 陳志剛 何雄偉

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,新疆 石河子 832008)

硫化氫在外源性SB203580預(yù)處理人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖中的作用

呂錫芳 陳志剛 何雄偉

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,新疆 石河子 832008)

目的探討硫化氫(H2S)供體硫氫化鈉(NaHS)對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、NaHS組、SB203580組、NaHS+SB203580組，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞周期分布，Western印跡檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞中P-p38MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，NaHS組SKOV3細(xì)胞增殖明顯增加，G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞明顯增加，且p-p38MAPK表達(dá)明顯增加(均P<0.01)；SB203580組、NaHS+SB203580組SKOV3細(xì)胞增殖均明顯減少，G1期細(xì)胞均明顯增加，S期細(xì)胞均明顯減少，且p-p38MAPK表達(dá)均明顯降低(均P<0.01)。而與NaHS組比較，SB203580組、NaHS+SB203580組SKOV3細(xì)胞增殖均明顯減少，G1期細(xì)胞均明顯增加，S期細(xì)胞均明顯減少，且p-p38MAPK表達(dá)均明顯降低(均P<0.01)；與SB203580組比較，NaHS+SB203580組SKOV3細(xì)胞的增殖明顯增加，G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞明顯增加，且p-p38MAPK表達(dá)明顯增加(均P<0.01)。結(jié)論H2S可能通過(guò)活化p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖。

卵巢癌細(xì)胞；硫化氫；p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路；細(xì)胞增殖

卵巢癌是女性惡性腫瘤中導(dǎo)致死亡的主要原因之一，尋找能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的藥物或因子具有重要意義。硫化氫(H2S)廣泛分布于心血管、內(nèi)臟和神經(jīng)系統(tǒng)等組織〔1〕。研究顯示，內(nèi)源性或外源性H2S能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡〔2～4〕，但具體機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而H2S可通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡〔5〕。本課題組觀察了H2S對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響，并探討p38MAPK 信號(hào)通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 SKOV3細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù))磷酸鹽緩沖液(PBS，上海生工)，二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、硫氫化鈉(NaHS，Sigma公司)，SB203580(德國(guó)Merck公司)，無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI)1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，無(wú)支原體胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，RNA酶(上海生工)，兔抗人磷酸化(p)-p38單克隆一抗(Cell Signal Technology公司)，二抗檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋有限公司)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo 公司)，變性型裂解液(北京索來(lái)寶公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)細(xì)胞復(fù)蘇后的SKOV3細(xì)胞，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后傳代培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組(加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液)，NaHS組(正常對(duì)照組基礎(chǔ)上加入NaHS，使其終濃度為50 μmol/L)，SB203580組(正常對(duì)照組基礎(chǔ)上加入SB203580，使終濃度為75 μmol/L)，NaHS+SB203580組(NaHS組基礎(chǔ)上加入SB203580，使其終濃度為75 μmol/L)，在恒溫培養(yǎng)箱中干預(yù)培養(yǎng)48 h。SB203580 組、SB203580+NaHS組分別在 NaHS 作用4 h后加藥。

1.4MTT法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖 SKOV3細(xì)胞以5×104個(gè)/ml，接種于96孔板內(nèi)，200 μl/孔，待細(xì)胞完全貼壁后，加入RPMI1640同步化24 h，然后按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)培養(yǎng)48 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組結(jié)束干預(yù)前4 h，每孔分別加入20 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO溶液150 ml/孔，室溫避光振蕩10 min，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值(A450)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)無(wú)細(xì)胞對(duì)照作為空白調(diào)零組，重復(fù)3次，并計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率(IR)=(A對(duì)照組值-A實(shí)驗(yàn)組值)/(A對(duì)照組值)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞周期分布 SKOV3細(xì)胞以5×105個(gè)/ml接種于6孔板內(nèi)，2 ml/孔，待細(xì)胞完全貼壁后，用RPMI1640同步化24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)培養(yǎng)48 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后消化收集細(xì)胞，用預(yù)先凍存的70%冰乙醇重懸細(xì)胞，吹打混勻，4℃固定過(guò)夜，過(guò)夜后離心去除乙醇，PBS 洗滌3遍，再用500 μl PBS重懸細(xì)胞，加入RNA酶，使其終濃度為250 μg/ml，于37℃孵育30 min，然后加入5 μl碘化丙啶染液，37℃避光保存30 min，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并按以下公式計(jì)算系膜細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=S期和G2/M期細(xì)胞比例之和/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例之和。

1.6Western印跡檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中p-p38蛋白表達(dá) SKOV3細(xì)胞以5×106個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，2 ml/孔，待細(xì)胞完全貼壁后，用RPMI1640同步化24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)培養(yǎng)48 h后，加入細(xì)胞裂解液，冰上靜置20 min，12 000 r/min 離心20 min，取上清后測(cè)定蛋白濃度，統(tǒng)一蛋白濃度為20 g/L，經(jīng)100℃水浴變性后待用。每孔每次加樣10 μl，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中電泳分離，位置標(biāo)記，半干轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫5%牛血清蛋白(BSA)封閉2 h，加一抗(1∶1 000)，4℃冰箱過(guò)夜，洗膜緩沖液(TBST)洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶30 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑曝光，顯影、定影后將膠片置于凝膠成像分析進(jìn)行定量分析。用同樣方法檢測(cè) β-肌動(dòng)蛋白(actin)的表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組SKOV3細(xì)胞增殖 與正常對(duì)照組比較，NaHS組明顯促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖，而SB203580組、NaHS+SB203580組均能明顯抑制SKOV3細(xì)胞增殖；與NaHS組比較，SB203580組、NaHS+SB203580組均能明顯抑制SKOV3細(xì)胞的增殖；而與SB203580組比較，NaHS+SB203580組能明顯促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖(均P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2各組干預(yù)48 h后SKOV3細(xì)胞周期分布 與正常對(duì)照組相比，NaHS組G0/G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞均明顯增加，而SB203580組、NaHS+SB203580組G0/G1期細(xì)胞均明顯增加，S期細(xì)胞均明顯減少；與NaHS組比較，SB203580組、NaHS+SB203580組G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少；與SB203580組比較，NaHS+SB203580組G0/G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞明顯增加(均P<0.01)。見(jiàn)表2、圖1。

2.3各組干預(yù)48 h后SKOV3細(xì)胞中p-p38MAPK的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，NaHS組中p-p38MAPK蛋白的表達(dá)顯著增加，而SB203580組、NaHS+SB203580組顯著降低；與NaHS組比較，SB203580組、NaHS+SB203580組顯著降低；而與SB203580組比較，NaHS+SB203580組顯著增加(均P<0.01)。見(jiàn)表2、圖2。

表1 各組SKOV3細(xì)胞增殖情況

與正常對(duì)照組相比:1)P<0.01；與NaHS組相比:2)P<0.01；與SB203580組比較:3)P<0.01；下表同

表2 各組干預(yù)48 h后SKOV3細(xì)胞周期分布及p-p38 MAPK的表達(dá)

圖1 各組干預(yù)48 h后SKOV3細(xì)胞周期分布

1.正常對(duì)照組，2.NaHS組，3.SB203580組，4.NaHS+SB203580組圖2 p-p38MAPK蛋白的表達(dá)(Western印跡法)

3 討 論

雖然目前手術(shù)及放化療等傳統(tǒng)治療手段不斷改進(jìn)，但卵巢癌總5年生存率仍<30%。Yan等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，低劑量NaHS(30～50 μmol/L)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞生存率，而高濃度NaHS(1 mmol/L)則抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Abrahamsen等〔7〕研究表明H2S可以啟動(dòng)凋亡機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。p38MAPK信號(hào)通路活化可以抑制多種細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖，在細(xì)胞增殖與凋亡中起重要作用。Keuling等〔8〕用SB203580特異性阻斷p38MAPK通路能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。本文結(jié)果說(shuō)明SKOV3細(xì)胞中存在p38MAPK信號(hào)通路，且p38MAPK信號(hào)通路可能參與了SKOV3細(xì)胞增殖的調(diào)控，當(dāng)此通路被抑制后，SKOV3細(xì)胞的增殖亦被顯著抑制。本研究說(shuō)明NaHS能明顯促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖，而當(dāng)運(yùn)用p38MAPK信號(hào)通路活抑制劑阻斷該通路，NaHS對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖作用也會(huì)減弱，甚至消失，p38MAPK蛋白表達(dá)亦明顯降低，這進(jìn)一步說(shuō)明SKOV3細(xì)胞中存p38MAPK信號(hào)通路，NaHS可能通過(guò)活化 p38MAPK信號(hào)通路而促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖。

1Martelli A，Testai L，Marino A，etal.Hydrogen sulphide：biopharmacological roles in the cardiovascular system and pharmaceutical perspectives〔J〕.Curr Med Chem，2012；19(20)：3325-36.

2Chattopadhyay M，Kodela R，Olson KR，etal.NOSH-aspirin (NBS-1120)，a novel nitric oxide-and hydrogen sulfide-releasing hybrid is a potent inhibitor of colon cancer cell growth in vitro and in a xenograft mouse model〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2012；419(3)：523-8.

3Chattopadhyay M，Kodela R，Nath N，etal.Hydrogen sulfide-releasing NSAIDs inhibit the growth of human cancer cells：a general property and evidence of a tissue type-independent effect〔J〕.Biochem Pharmacol，2012；83(6)：715-22.

4周建斌，盛順良，周壽紅，等.外源性硫化氫通過(guò) PI3K/Akt 信號(hào)通路誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡〔J〕.中國(guó)婦幼保健雜志，2013；28(30)：5029-32.

5徐 霞，李 睿，任 薔，等.硫化氫在SB203580影響肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡中的作用〔J〕.天津醫(yī)藥，2013；41(11)：1095-8.

6Yan SK，Chang T，Wang H.Effects of hydrogen sulfide on homocysteine-induced oxidative stress in vascular smooth muscle cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006；351(2)：485-91.

7Abrahamsen H，Stenmark H，Platta HW.Ubiquitination and phosphorylation of Beclin 1 and its binding partners：tuning class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase activity and tumor suppression〔J〕.FEBS Lett，2012；586(11)：1584-91.

8Keuling AM，Andrew SE，Tron VA.Inhibition of p38 MAPK enhances ABT-737-induced cell death in melanoma cell lines：novel regulation of PUMA〔J〕.Pigment Cell Melanoma Res，2010；23(3)：430-40.

〔2016-07-08修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

國(guó)家重大攻關(guān)專項(xiàng)(No.2013GS650104)

何雄偉(1980-)，男，主治醫(yī)師，主要從事心理疾病研究。

呂錫芳(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

R737.3

A

1005-9202(2017)17-4188-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.008