王瑞婷 王愛霞 狄婷婷 張 美 申興斌

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

β淀粉樣蛋白25～35對PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

王瑞婷 王愛霞 狄婷婷 張 美 申興斌1

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的探討β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35對PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。方法采用不同濃度的Aβ25～35與PC12細胞共孵育48 h后,用MTT法檢測細胞生長活性，Hoechst33258核染色檢測細胞凋亡，通過免疫細胞化學(xué)檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達。結(jié)果MTT檢測顯示Aβ25～35抑制PC12細胞生長活性呈濃度依賴性，抑制作用隨Aβ25～35濃度的增大而加強；Hoechst33258染色顯示Aβ25～35與PC12細胞凋亡呈濃度依賴性關(guān)系；免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示Bcl-2蛋白表達量隨Aβ25～35濃度的增大呈下降趨勢，Bax、Caspase-3蛋白表達量隨Aβ25～35濃度的增大呈上升趨勢。結(jié)論Aβ25～35可劑量依賴性誘導(dǎo)PC12細胞凋亡，使抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表達上調(diào)。

β淀粉樣蛋白；PC12；凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3

阿爾茨海默病(AD)患者腦內(nèi)的老年斑由β淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積形成。Aβ作為AD發(fā)病的始動因子已得到廣泛的認可〔1〕，研究發(fā)現(xiàn)Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,其機制成為AD的發(fā)病機制研究熱點之一〔2,3〕。Aβ由39～43個氨基酸組成，引起神經(jīng)毒性主要活性部位在第25～35氨基酸之間(Aβ25～35)〔4〕。Aβ對在體及體外神經(jīng)元的毒性作用依賴于其聚集狀態(tài)與濃度，為進一步分析其作用機制，本課題分析離體實驗中Aβ25～35對PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 Aβ25～35(Lot：990307)由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；MTT(Lot:08E21C01),一抗兔抗大鼠Bcl-2多抗(Lot:195841)、兔抗大鼠Bax多抗(Lot:11201)、兔抗大鼠Caspase-3多抗(Lot:Y-C4-08D22C),即用型SABC試劑盒(Lot：08A22C)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(Lot：08A04A22)，由武漢博士德生物工程有限公司提供。PC12細胞(CX0247)，胎牛血清(FBS)(Lot：10J30C01)由武漢博士德生物工程有限公司提供；DMEM(Lot:681841)由Gibco提供；胰酶(Lot:CAS#9035-81-8)由上海藍基科技發(fā)展有限公司提供。

1.2凝聚態(tài)Aβ25～35制備 用超純水將凍干的Aβ25～35充分溶解配置100 μmol/L母液并過濾分裝，-20℃保存，使用前于37℃恒溫箱孵育5～7 d使其形成凝膠態(tài)，取適量加入培養(yǎng)細胞中使達到所需終濃度。

1.3細胞培養(yǎng) PC12細胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)在含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中，內(nèi)含青霉素、鏈霉素各100 U/ml,隔天換液，4 d傳一代。采用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4MTT法檢測細胞生長活性 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度5×107/L，每孔加入100 μl，邊緣孔用無菌PBS填充,5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底;加入濃度梯度的Aβ25～35，使其終濃度為0.1、1、2、5、10、20 μmol/L，同時設(shè)立對照孔和調(diào)零孔,每組設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；每孔加入10 μl MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。每孔加入100 μl Formanzan溶解液，置搖床上低速振蕩10～30 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm測定吸光度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(加藥細胞OD-調(diào)零孔OD值)/(對照細胞OD-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.5細胞爬片制備 取在70%乙醇中浸泡的潔凈蓋玻片，用無菌的PBS溶液洗滌3遍，再用細胞培養(yǎng)液洗滌1遍，將蓋玻片置于24孔板，種入對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)過夜，使爬片約為80%滿。由MTT檢測結(jié)果選擇3個濃度梯度的Aβ25～35,刺激細胞48 h,并設(shè)置對照組。48 h后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液，固定10 min,去固定液，自然晾干5 min,用PBS洗兩次，每次3 min，吸盡液體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6Hoechst33258核染色 每張爬片加入0.5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min；去染色液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體；滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的爬片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡；熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核，激發(fā)波長350 nm左右，發(fā)射波長460 nm左右。

1.7免疫細胞化學(xué)染色 細胞爬片用0.25%TritonX-100室溫處理15 min,PBS洗3次，用3%H2O2室溫處理15 min以滅活內(nèi)源性酶,PBS洗3次，5%BSA37℃封閉20 min，吸盡封閉液，不漂洗；加一抗Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶100)、Caspase-3(1∶100)，4℃過夜。第2天37℃孵育25 min，PBS洗3次，山羊抗兔IgG 37℃孵育20 min,PBS洗3次，SABC37℃孵育20 min,PBS洗3次，DAB顯色2～10 min，光鏡下觀察陽性顯色為棕黃色，用蒸餾水沖洗10 min終止反應(yīng)。蘇木素輕度復(fù)染5～10 min，70%、80%、95%、100%乙醇各5 min,二甲苯10 min,甘油封片后光學(xué)顯微鏡進行觀察。每組選取3張爬片，光鏡下每張爬片隨機選取3個不重復(fù)視野在400倍視野下采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)，測量每組爬片的平均光密度值，用于定量分析免疫細胞化學(xué)陽性反應(yīng)程度。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Aβ25～35對PC12細胞活力的影響 Aβ25～35與PC12細胞活力呈現(xiàn)濃度依賴性的關(guān)系，低濃度Aβ25～35對PC12細胞活力影響小，隨著Aβ25～35濃度的增大，PC12細胞活力明顯受到抑制。1 μmol/L以上濃度組Aβ25～35刺激48 h后即可出現(xiàn)細胞活力明顯下降(P<0.05),Aβ25～35濃度達到10 μmol/L時，細胞存活率達到48.7%，此濃度已顯示出較強的細胞毒性作用。后續(xù)實驗采用0、1、5、10 μmol/L的Aβ25～35。見表1。

表1 不同濃度Aβ25～35對PC12細胞細胞活力的影響

與0 μmol/L Aβ25～35比較：1)P<0.05；與0.1 μmol/L Aβ25～35比較：2)P<0.05

圖1 不同劑量Aβ25～35對PC12細胞凋亡的影響(Hoechst33258,×400)

2.2Hoechst33258核染色觀察Aβ25～35對PC12細胞凋亡的影響 見圖1。Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈藍色，凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。實驗采用0、1、5、10 μmol/L的Aβ25～35作用PC12細胞48 h，顯示對照組細胞的細胞核呈藍色，僅有個別細胞的細胞核顏色有些發(fā)白；而Aβ25～35組細胞,呈現(xiàn)細胞核濃染或顆粒狀熒光團塊增多，隨Aβ25～35濃度增大細胞核呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白的趨勢增強，即Aβ25～35與PC12細胞凋亡呈濃度依賴性關(guān)系。

2.3不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Bcl-2表達水平的影響 鏡下可見PC12細胞Bcl-2陽性反應(yīng)為胞質(zhì)棕黃色顆粒，有時可見核膜著棕黃色。Bcl-2免疫細胞化學(xué)顯示對照組和不同濃度Aβ25～35組均有Bcl-2陽性表達，與對照組相比，不同濃度Aβ25～35組Bcl-2陽性表達均明顯減少(P<0.05);隨著濃度增加Bcl-2陽性表達逐漸減少，不同濃度組間差異顯著(P<0.05)。Bcl-2表達量與Aβ25～35濃度相關(guān)，Aβ25～35濃度越大，Bcl-2陽性表達越少。見圖2，表2。

2.4不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Bax表達的影響 PC12細胞Bax陽性反應(yīng)為胞質(zhì)棕黃色顆粒,有時可見核膜著棕黃色。與對照組相比，各Aβ25～35組Bax陽性表達均明顯增加(P<0.05)，隨Aβ25～35濃度增加Bax陽性表達逐漸增加，10 μmol/L組胞核黃染，著色深，不同Aβ25～35組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。Bax表達量與Aβ25～35濃度相關(guān)，Aβ25～35濃度越大，Bax陽性表達越多。見圖3，表2。

圖2 不同劑量Aβ25～35對PC12細胞Bcl-2 表達的影響(DAB，×400)

表2 不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與1 μmol/L Aβ25～35比較：2)P<0.05；與5 μmol/L Aβ25～35比較：3)P<0.05

2.5不同濃度Aβ25～35對PC12細胞Caspase-3表達水平的影響 PC12細胞Caspase-3陽性反應(yīng)為胞質(zhì)著棕黃色顆粒。與對照組相比，不同濃度Aβ25～35組Caspase-3陽性表達均明顯增加(P<0.05);隨Aβ25～35濃度增加，Caspase-3陽性表達逐漸增強，10 μmol/L組胞核黃染，著色深，不同濃度組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。Caspase-3表達量與Aβ25～35濃度相關(guān)，Aβ25～35濃度越大，Caspase-3陽性表達越多。Caspase-3的表達量與Aβ25～35濃度呈依賴性相關(guān)。見圖4，表2。

圖4 不同劑量Aβ25～35對PC12細胞Caspase-3表達的影響(DAB，×400)

3 討 論

研究表明凋亡是AD病程中神經(jīng)元大量丟失的主要原因〔5，6〕,但其具體機制尚不明確。細胞凋亡是受促凋亡基因和抑制凋亡基因協(xié)同控制的細胞主動死亡過程。目前認為Bcl-2,Bax,Caspase-3基因與凋亡調(diào)控關(guān)系更為密切。Bcl-2基因促進細胞增殖，過度表達可特異性抑制細胞凋亡。有研究證實Bcl-2過表達可減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡〔7～9〕，可能減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元病理后遺癥〔10〕。本實驗結(jié)果顯示隨著Aβ濃度的增大，Bcl-2 表達逐漸減弱，對神經(jīng)元保護作用減弱，神經(jīng)元凋亡明顯。Bcl-2抗凋亡的機制目前認為主要有：拮抗促凋亡基因Bax；抑制促凋亡的蛋白質(zhì)細胞色素C自線粒體釋放到胞質(zhì)；阻止胞質(zhì)中的細胞色素C激活Caspase；有抗氧化及維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等作用。Bax基因?qū)儆贐cl-2 基因家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2 產(chǎn)生阻抑作用。Bax基因過度表達加速細胞凋亡，并對抗Bcl-2基因抑制細胞凋亡的作用〔11，12〕。研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2蛋白之間的比例關(guān)系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵因素〔13〕，促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有表達，其比值的大小決定神經(jīng)元受到凋亡信號刺激后趨向于存活與凋亡的抉擇，形成細胞凋亡調(diào)控的按鈕〔14〕。有研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Bax蛋白水平的表達和Bax/Bcl-2比值增大可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡〔15〕，腦室內(nèi)低溫能夠通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低急性腦缺血后神經(jīng)元凋亡〔16〕。劉真苓等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)腺苷處理后可減少犬脊髓缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡，其保護作用可能與Bax表達減少和Bcl-2表達增多有關(guān)。近期有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)梔子苷通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達水平及轉(zhuǎn)錄因子p53水平可延緩AD的發(fā)展〔18〕。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著Aβ濃度增大，抗凋亡的Bcl-2表達逐漸降低，促凋亡的Bax表達逐漸增強，Bax/bcl-2比值增加，神經(jīng)元凋亡明顯。促凋亡的Bax與抗凋亡的Bcl-2兩者之間的比值同時決定促凋亡基因Caspase-3的激活程度〔19〕。Caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用，Caspase-3激活與cyt-c自線粒體釋放、線粒體損傷、神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)〔20〕。Caspase-3是激活細胞凋亡的關(guān)鍵因子，進一步激活其它凋亡蛋白表達，致細胞不可逆性凋亡。由死亡受體、線粒體/細胞色素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細胞凋亡的三類信號通路，最終均會引起Caspase瀑布效應(yīng)〔21〕。Aβ可以引起活性氧(ROS)增多〔22〕，通過ROS引起cyt-c釋放，激活Caspase引起Caspase依賴性凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)高濃度Aβ使Bax/Bcl-2比值增大，Caspase-3表達增加。本研究組在整體實驗研究中也發(fā)現(xiàn)Aβ對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響〔23〕。

Aβ25～35能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)PC12細胞凋亡，其機制可能為通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表達實現(xiàn)。因此，進一步通過篩選具有上調(diào)Bcl-2蛋白表達,抑制Bax,Caspase-3蛋白表達活性，抑制神經(jīng)元凋亡，延緩AD病程發(fā)展的藥物，將成為AD的研究熱點之一。

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〔2016-05-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省教育廳重點資助課題(No.ZD20131051);河北省高校省級重點學(xué)科項目資助(〔2013〕4號);河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室資助(2014年)

王瑞婷(1969-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥抗癡呆作用及機制研究。

R749

A

1005-9202(2017)17-4179-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.005

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院