盧 強(qiáng) 陳燕春 劉永新 接琳琳 王巧真 杜紅梅 宋 妍 侯 琛 周風(fēng)華

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,山東 濰坊 261053)

鈣反應(yīng)性反式激活因子在肌萎縮側(cè)索硬化癥轉(zhuǎn)基因鼠中的表達(dá)及意義

盧 強(qiáng) 陳燕春1劉永新1接琳琳1王巧真2杜紅梅1宋 妍 侯 琛 周風(fēng)華

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,山東 濰坊 261053)

目的探討鈣反應(yīng)性反式激活因子(CREST)在肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)轉(zhuǎn)基因鼠脊髓及腦干組織中的表達(dá)變化及相關(guān)性作用。方法分別取出生后95 d、108 d、122 d(早、中、晚期)野生型與SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠，通過(guò)RT-PCR、蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)脊髓組織中CREST mRNA及蛋白水平表達(dá)變化，通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)脊髓及腦干組織中CREST的表達(dá)變化及與神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的共表達(dá)情況。結(jié)果①與野生型鼠相比較，SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓組織中CREST蛋白水平下調(diào)(P<0.05)，在mRNA水平變化并不明顯。②免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)顯示，CREST主要表達(dá)于細(xì)胞核，與神經(jīng)元有共表達(dá)，與星形膠質(zhì)細(xì)胞不存在共表達(dá)；與野生型鼠比較，SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓和腦干組織中CREST表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論CREST的差異表達(dá)可能與ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能障礙有關(guān)。

鈣反應(yīng)性反式激活因子；肌萎縮側(cè)索硬化癥

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性變性為主要病變特點(diǎn)的慢性神經(jīng)退行性疾病，主要累及脊髓、腦干〔1〕。ALS發(fā)病與谷氨酸興奮性毒性、炎癥及細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制有關(guān)，但具體機(jī)制目前尚未明確〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，在ALS發(fā)病過(guò)程中存在突觸結(jié)構(gòu)及功能的異常，而神經(jīng)元內(nèi)蛋白的異常聚集會(huì)導(dǎo)致樹突棘密度減少而引起突觸異常，從而導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙〔3〕。鈣反應(yīng)性反式激活因子(CREST)是一種反式激活因子，在正常神經(jīng)元樹突的生長(zhǎng)過(guò)程中是必需的，在培養(yǎng)的大鼠胚胎皮層神經(jīng)元中，能夠抑制樹突的生長(zhǎng)和促進(jìn)其分支發(fā)育〔4〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討CREST在ALS發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及標(biāo)本 野生型及突變型SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠由美國(guó)Jackson Laboratories提供。轉(zhuǎn)基因鼠飼養(yǎng)、合籠及子代鼠鑒定按照吳欣等〔5〕方法進(jìn)行。分別于ALS 轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)病不同時(shí)間點(diǎn)(95 d，108 d，122 d)取材，以同窩野生型鼠作為對(duì)照，提取脊髓總RNA、蛋白，并制備脊髓及腦干組織冰凍切片〔6〕。

1.2主要試劑 兔抗CREST多克隆抗體 (1∶100，武漢三鷹)，雞抗β-tubulinⅢ(1∶100，R&D)多克隆抗體，雞抗膠原纖維酸性蛋白(GFAP，1∶400，Abcam)多克隆抗體，Alexa Fluor-488標(biāo)記的驢抗雞IgY、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國(guó)Jackson Immuno Research Laboratoris)，OligdT、5×逆轉(zhuǎn)錄Buffer、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)，Taq PCR Master Mix (2×)(北京天根生化科技有限公司)，TRIzol(Life Technologies)。

1.3RT-PCR TRIzol一步法提取脊髓RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA〔5〕。以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)體系： 2×PCR mix 10 μl，CREST上下游引物各1 μl，β-actin上下游引物各0.6 μl，cDNA 1 μl，滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至20 μl，循環(huán)條件：開始94℃ 3 min，然后94℃ 30 s，57℃30 s和72℃30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃5 min，冷卻至4℃?zhèn)溆?，瓊脂糖凝膠電泳并拍照。CREST上游引物：5′CCACCTCCATGAGCATCTCT3′，下游引物：5′TGGTCCGAGACACGTAGTTG3′ (擴(kuò)增片段長(zhǎng)度108 bp)；β-actin上游引物：5′ CGTTGACATCCGTAAAGACC3′，下游引物：5′ ACAGTCCGCCTAGAAGCAC 3′ (擴(kuò)增片段長(zhǎng)度280 bp)。

1.4免疫印跡〔6〕應(yīng)用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，按120 μg蛋白/每孔上樣。兔抗CREST抗體(1∶1 000)和小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜；HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗常溫孵育2 h?；瘜W(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光，暗室曝光。

1.5免疫熒光雙標(biāo)記〔6〕將處理好的脊髓及腦干組織制備冰凍切片，厚10 μm，室溫下晾干后行免疫熒光雙標(biāo)記染色。一抗為兔抗CREST抗體(1∶100)分別與雞抗β-tubulinⅢ(1∶100)及雞抗GFAP(1∶400)混合液。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用圖像分析軟件IPP5.1檢測(cè)圖片累積光密度及陽(yáng)性細(xì)胞IOD值。使用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CREST蛋白及mRNA水平在脊髓組織中的表達(dá)變化 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與同一時(shí)間點(diǎn)野生型鼠(95 d：2.48±0.098，108 d：2.63±0.085,122 d:2.51±0.072)相比，ALS鼠脊髓組織中CREST在蛋白水平表達(dá)下調(diào)(95 d:1.32±0.081,108 d:1.34±0.045,122 d:1.25±0.070;P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，與同一時(shí)間點(diǎn)野生型鼠(95 d：0.49±0.046，108 d:0.47±0.045,122 d:0.50±0.050)相比，ALS鼠脊髓組織中CREST mRNA水平變化并不明顯(95 d:0.46±0.010,108 d:0.48±0.036,122 d:0.46±0.053;P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2CREST免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè) 見(jiàn)圖2。CREST主要表達(dá)于細(xì)胞核。在脊髓組織中，CREST陽(yáng)性細(xì)胞位于脊髓灰質(zhì)，尤其見(jiàn)于退行性變較明顯的脊髓前角；在腦干組織中多個(gè)部位均可查見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，在舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核以及紅核(RMC)有差異表達(dá)，在脊髓及腦干各部位，CREST均與神經(jīng)元有共表達(dá)，與星形膠質(zhì)細(xì)胞不存在共表達(dá)。與野生型鼠比較，ALS鼠中CREST表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。

GM：脊髓前角，7N：面神經(jīng)核，12N：舌下神經(jīng)核，標(biāo)尺=20 μm圖2 CREST與β-tubulinⅢ在ALS轉(zhuǎn)基因鼠122 d脊髓前角及腦干神經(jīng)核團(tuán)的免疫熒光雙標(biāo)記

3 討 論

ALS是一種致死性的慢性神經(jīng)退行性疾病，由于大腦皮層、腦干及脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性導(dǎo)致了進(jìn)行性肌肉麻痹〔7〕，在ALS發(fā)病中腦干的舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核及RMC的退變明顯，主要癥狀表現(xiàn)為吞咽困難和構(gòu)音障礙，脊髓發(fā)病型由脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性引起，主要癥狀表現(xiàn)為肢體肌肉的進(jìn)行性麻痹。CREST是一種SYT相關(guān)核蛋白〔8〕，結(jié)構(gòu)上包括3個(gè)功能域：①C-末端的轉(zhuǎn)錄活性域介導(dǎo)鈣誘導(dǎo)的反式激活〔9〕；②N-末端能夠抑制基礎(chǔ)狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄活性；③中間是富含甲硫氨酸的一個(gè)多功能結(jié)構(gòu)域，與蛋白質(zhì)的二聚化、轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)以及蛋白的亞細(xì)胞定位有關(guān)〔10〕。 研究發(fā)現(xiàn)，CREST對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是非常重要的，對(duì)于維持正常神經(jīng)元樹突的生長(zhǎng)過(guò)程是必需的，在培養(yǎng)的大鼠胚胎皮層神經(jīng)元中，能夠抑制樹突的生長(zhǎng)和促進(jìn)其分支的發(fā)育〔4〕，缺乏CREST的小鼠神經(jīng)元樹突的生長(zhǎng)和分枝明顯減少，并且大多數(shù)小鼠出生后會(huì)死亡〔8〕。本文發(fā)現(xiàn)ALS鼠CREST蛋白水平表達(dá)下調(diào)，提示CREST蛋白與ALS的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，并且CREST的異常表達(dá)可能與神經(jīng)元的功能異常有關(guān)。

1Lemarchant S，Pomeshchik Y，Kidin I，etal.ADAMTS-4 promotes neurodegeneration in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Neurodegener，2016;11(1)：10.

2Nanou A，Higginbottom A，Valori CF，etal.Viral delivery of antioxidant genes as a therapeutic strategy in experimental models of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Ther，2013;21(8)：1486-96.

3Gorrie GH，F(xiàn)ecto F，Radzicki D，etal.Dendritic spinopathy in transgenic mice expressing ALS/dementia-linked mutant UBQLN2〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2014;111(40)：14524-9.

4Pradhan A，Liu Y.A multifunctional domain of the calcium-responsive transactivator (CREST)that inhibits dendritic growth in cultured neurons〔J〕.J Biol Chem，2005;280(26)：24738-43.

5吳 欣，管英俊，于 麗，等.Wnt抑制因子-1在肌萎縮脊髓側(cè)索硬化癥轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)變化〔J〕，解剖學(xué)報(bào)，2011;42(5)：588-93.

6陳燕春，劉煥彩，管英俊，等.Akt在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥轉(zhuǎn)基因鼠脊髓中的表達(dá)變化及意義〔J〕.解剖學(xué)雜志，2014；30(3)：331-4.

7Al-Chalabi A，Jones A，Troakes C，etal.The genetics and neuropathology of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Acta Neuropathol，2012；124(3)：339-52.

8Aizawa H，Hu SC，Bobb K，etal.Dendrite development regulated by CREST，a calcium-regulated transcriptional activator〔J〕.Science，2004；303(5655)：197-202.

9Valero T，Moschopoulou G，Kintzios S，etal.Studies on neuronal differentiation and signalling processes with a novel impedimetric biosensor〔J〕.Biosens Bioelectron，2010；26(14)：1407-13.

10Iukharsky MS,Quintiero A,Matsumoto T,etal.Calcium-responsive transactivator (CREST)protein shares a set of structural and functional traits with other proteins associated with amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Neurodegener，2015；10(1)：20.

〔2016-02-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Expressionofcalcium-responsivetransactivatorinALStransgenicmice

LUQiang,CHENYan-Chun,LIUYong-Xin,etal.

DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,Shandong,China

ObjectiveTo investigate the expression of calcium-responsive transactivator (CREST) in the spinal cord and brainstem of ALS transgenic mice,and explore the role and significance of CREST in the pathogenesis of ALS.MethodsThe mRNA and protein level of CREST were detected by RT-PCR and Western blot in the spinal cord of ALS transgenic mice at the different stages of disease (post-natal 95 d,108 d and 122 d). The immunofluorescence was used to detect the coexpression of CREST/β-tubulinIII and CREST/GFAP in the spinal cord and brain stem.ResultsCompared with that of wild type mice,the protein level of CREST in the spinal cord tissue was down-regulated (P<0.05),but not significant at mRNA level. CREST was mainly expressed in the nucleus. CREST-positive cells were also β-tubulinIII positive but GFAP negative. Compared with that of wild-type mice,CREST level of SOD1-G93A transgenic mice in the spinal cord and brain stem was down-regulated (P<0.05).ConclusionsThe differential expression of CREST may be related to the dysfunction of motor neurons in ALS.

Calcium-responsive transactivator; ALS

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81271413，81401066)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012GSF11827)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2012HQ021)；山東省教育廳課題(J12LK51，J13LK05)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0279)

周風(fēng)華(1977-)，女，副教授，碩士，主要從事神經(jīng)發(fā)育與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)研究。

盧 強(qiáng)(1988-)，男，在讀碩士，主要從事神經(jīng)發(fā)育與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)研究。

R744.8

A

1005-9202(2017)17-4177-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.004

1 濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室

2 濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室