王子珍 鄭傳宜 楊 堃

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570100)

兔腦缺血后自噬激活與ROCK-JNK信號(hào)通路的關(guān)系

王子珍 鄭傳宜 楊 堃

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 海口 570100)

目的探討腦缺血后神經(jīng)元自噬激活與Rho蛋白激酶(ROCK)-C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)信號(hào)通路的關(guān)系。方法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦缺血兔腦模型，檢測腦組織梗死面積確定模型是否成功。在二次注血后的不同時(shí)間處死模型，取腦缺血區(qū)域腦組織，行Western印跡檢測腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞壞死、凋亡和自噬現(xiàn)象。通過Western印跡檢測自噬抗體蛋白在兔腦模型中的表達(dá)情況。免疫組化檢測腦缺血區(qū)域的自噬蛋白和ROCK-JNK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果采用 Longa 線栓法建立 SAH 模型成功率較高。兔腦組織中存在神經(jīng)元細(xì)胞壞死、凋亡和自噬現(xiàn)象，模型組腦組織梗死面積相比對(duì)照組增多。Western印跡及免疫組化證實(shí)遲發(fā)型血管痙攣與神經(jīng)元細(xì)胞自噬存在關(guān)聯(lián)。結(jié)論腦缺血后的腦組織中存在神經(jīng)元自噬現(xiàn)象且和ROCK-JNK信號(hào)通路存在一定關(guān)系。

腦缺血；ROCK；JNK；自噬

腦缺血后最常見也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥就是遲發(fā)型腦血管痙攣(DCVS)，其中約 30%可發(fā)生延遲性腦缺血神經(jīng)功能障礙〔1～3〕。有研究表明，DCVS后可以激活神經(jīng)元細(xì)胞自噬，通過電鏡發(fā)現(xiàn)，在大腦皮層的神經(jīng)元細(xì)胞中有自噬-溶酶體的激活〔4〕，在蛋白分子水平上也可以檢測到自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中ATG5/LC3是目前公認(rèn)的重要的自噬體標(biāo)志物〔5〕。Beclin-1也是哺乳動(dòng)物發(fā)生自噬過程中不可或缺的組分。因此，通過檢測幾種自噬蛋白標(biāo)志物的表達(dá)可以有效表明自噬過程的存在。Rho蛋白激酶(ROCK)是絲氨酸蛋白激酶家族成員，為Rho/ROCK信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，也是Rho下游功能機(jī)制研究比較清楚的效應(yīng)因子之一〔6〕。有研究表明Rho/ROCK信號(hào)通路可以激活C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)的信號(hào)通路，通過激活JNK通路中的小分子GTP酶，經(jīng)過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)C-jun的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬功能〔7～10〕。本研究通過檢測自噬蛋白和ROCK/JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白表達(dá)水平，探討DCVS后的自噬激活與ROCK/JNK信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1兔缺血再灌注模型制作 兔購于河南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共180只，體重2.5～3.0 kg，4～5月齡，在清潔安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。采用 Longa線栓法制作缺血再灌注模型，兔腦缺血2 h后恢復(fù)再灌注。判定采用 Longa 5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法神經(jīng)功能缺損評(píng)分：0分：正常，未見任何神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)；1分：垂直提起時(shí)病灶對(duì)側(cè)肢體不能伸直；2分：行走時(shí)身體向病灶對(duì)側(cè)傾斜或旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)身體向病灶對(duì)側(cè)跌倒；4分：出現(xiàn)意識(shí)障礙或不能自發(fā)行走。評(píng)分為 0 分或 4 分、不明原因或明確原因提前死亡、術(shù)中出血過多、生命體征不穩(wěn)定及處死時(shí)發(fā)現(xiàn)存在蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的兔模型不予采納并隨時(shí)補(bǔ)充。未行處理的納入對(duì)照組。

1.2石蠟包埋及免疫組化 常規(guī)石蠟包埋兔腦組織，組織切片厚5 μm。免疫組化步驟按免疫組化S-P試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)說明書操作：載玻片脫蠟、水化，然后在枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0；Sigma)中運(yùn)用微波爐抗原修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫。PBS洗3次3 min，3%H2O2室溫孵育15 min，PBS洗3次3 min，5%羊血清(ab7475，Abcam Company)37℃水浴30 min，一抗體(1∶100，ab14513,Abcam Company)，37℃水浴2 h，PBS洗3次3 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶300，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PBS洗3次3 min，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)37℃水浴30 min，PBS洗3 min×3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3Western印跡 裂解組織以每孔25 μg上樣后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，依次加入:LC3和Beclin1單克隆抗體(稀釋度1∶5 000和1∶2 000)和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，化學(xué)熒光發(fā)光法(ECL)顯影(碧云天公司)，操作過程按說明書進(jìn)行。用凝膠成像系統(tǒng)成像對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析，相對(duì)表達(dá)量以相應(yīng)灰度面積積分與內(nèi)參的比值計(jì)算。

1.4免疫組織化學(xué) 取與痙攣血管相應(yīng)的供血區(qū)兔腦組織，利用SP試劑盒行免疫組化染色，并在共聚焦顯微鏡下觀察。選用的抗體包括ROCK、JNK、LC3及Beclin1。各組選擇頂葉缺血區(qū)周圍皮質(zhì)作為觀察部位，在高倍鏡(×400)下隨機(jī)取 3 個(gè)不重疊的視野拍照，利用 Image-pro plus6.0 圖像分析軟件分析每個(gè)視野 ROCK、JNK、LC3、Beclin1的平均光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0行單因素方差分析，方差不齊者用Karuskal-wallis方法處理。

2 結(jié) 果

2.1兔腦缺血再灌注模型神經(jīng)功能缺損評(píng)估 90只成功造模的模型兔神經(jīng)功能評(píng)分：1 分 45 只，2 分 31 只，3 分 14只。行為觀測：對(duì)照組一般生活情況佳，未出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能紊亂癥狀；模型組栓塞動(dòng)脈后2 h神經(jīng)功能評(píng)價(jià)出現(xiàn)明顯差別，一般生活情況差，精神不振、反應(yīng)遲鈍、食欲不佳等，神經(jīng)缺損癥狀與體征明顯。見表1。

2.2腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)梗死體積 模型組可觀察到大腦皮層下出現(xiàn)大片梗死灶，呈白色，對(duì)照組梗死灶面積〔(11.65±1.67)%〕與模型組〔(29.37±2.89%)〕比較明顯減少(P<0.05)。

2.3大腦缺血半球皮層自噬標(biāo)志蛋白 LC3 和 Beclin-1 水平的

變化 對(duì)照組兔大腦缺血半球皮層 LC3的表達(dá)水平較低(0.130±0.044)。模型組兔腦缺血半球皮層 LC3 蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。Beclin-1 蛋白表達(dá)水平趨勢與LC3相同，對(duì)照組表達(dá)水平較低(0.187±0.021)，模型組蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖1。

2.4大腦缺血半球皮層ROCK-JNK自噬激活情況 ROCK在各組雖然有不同程度表達(dá)，但表達(dá)總體水平較低。模型組蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，JNK在模型組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。LC3和Beclin-1蛋白在模型組腦組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖2。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

圖1 兔大腦缺血半球皮層LC3 和 Beclin-1 水平的變化

圖2 免疫組化法顯示各組大腦缺血半球皮層ROCK-JNK自噬的激活情況(×400)

3 討 論

有研究表明，Rho可以通過ROCK直接激活JNK，調(diào)控c-Jun的表達(dá)，但是這種調(diào)控不單單是依靠ROCK的聚合解聚作用，而是通過靶向因子的信號(hào)傳導(dǎo)〔11～13〕。在乙二醇誘導(dǎo)星形細(xì)胞自噬的過程中，發(fā)現(xiàn)抑制Rho小分子GTP酶和ROCK激酶后，自噬細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白磷酸化后引發(fā)收縮〔14〕。因此我們考慮ROCK的激活可以調(diào)控自噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，可以引起細(xì)胞膜發(fā)泡，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞識(shí)別并介導(dǎo)自噬的發(fā)生。

在大部分真核生物體內(nèi)，JNK通路是MAPKs信號(hào)通路的一種，主要介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡、增殖、分化等一系列的生物學(xué)行為，而且在神經(jīng)元細(xì)胞中都有表達(dá)〔15〕。有研究證明，JNK信號(hào)通路和大腦缺血再灌注之間有密切的關(guān)聯(lián)〔16〕。近年來，不斷有學(xué)者報(bào)道指出，JNK3和神經(jīng)元細(xì)胞的自噬凋亡有一定聯(lián)系，在腦卒中靶向治療中是一個(gè)潛在有效靶點(diǎn)〔17〕。有研究表明，JNK的激活可以對(duì)神經(jīng)元造成不可逆的損傷，在損傷30～60 min后癥狀最明顯，且應(yīng)用抑制劑可以減少其損傷程度〔18〕；而ROCK可以在自噬過程中激活JNK，加重神經(jīng)元的再灌注損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦缺血后神經(jīng)元細(xì)胞存在自噬現(xiàn)象，可能是通過ROCK-JNK雙向調(diào)控激活自噬的發(fā)生。

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〔2017-02-16修回〕

(編輯 郭 菁)

TherelationshipbetweencerebralischemiaautophagyactivationwithROCK-JNKsignalingpathway

WANGZi-Zhen,ZHENGChuan-Yi,YANGKun.

DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofHannanMedicalCollege,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo explore the relationship between cerebral ischemia autophagy activation with ROCK-JNK signaling pathway.MethodsThe subarachnoid hemorrhage cerebral ischemic rabbit brain models were induced to test the extent of brain tissue. After double injection at different times, the rabbits were sacrificed, and brain ischemic area of brain tissue were detected by Western blot.The expressions of ROCK-JNK signaling pathway proteins were detected by immunohistochemical method.ResultsNeuronal cell necrosis, apoptosis and autophagy phenomenon were observed in rabbit brain tissues. Western blot and immunohistochemistry confirmed the association between late onset vasospasm and neuronal autophagy.ConclusionsThe neurons autophagy exists in the brain tissue after ischemia, and ROCK-JNK signaling pathway is a certain relationship with autophagy.

Cerebral ischemia; ROCK; JNK; Autophagy

國家自然科學(xué)基金(81260371)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20158300)

王子珍(1966-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腦腫瘤及腦血管病的診斷與治療研究。

R743.31

A

1005-9202(2017)17-4173-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.002