伍香玲

(川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，四川 南充 637007)

急性白血病治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3的表達(dá)水平及意義

伍香玲

(川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，四川 南充 637007)

目的探討急性白血病治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)的表達(dá)水平及意義。方法選取2015年2月至2017年3月我院收治的25例急性白血病患者(研究組)及同期我院體檢的25例健康志愿者及其供體的骨髓(健康組)，將單個(gè)核細(xì)胞分離后提取DNA，受試患者接受標(biāo)準(zhǔn)方案化療治療，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞上Tim-3 mRNA表達(dá)量。結(jié)果研究組治療前外周血T細(xì)胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于健康組及治療后(P< 0.05)；而研究組治療后外周血T細(xì)胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量與健康組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；急性白血病患者臨床療效與Tim-3基因表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)(P< 0.05)。結(jié)論Tim-3基因在急性白血病初治患者中存在明顯高表達(dá)現(xiàn)象，其表達(dá)水平高低在急性白血病患者治療效果的評(píng)估中有一定積極作用。

急性白血病；治療；Tim-3；臨床意義

急性白血病為臨床常見(jiàn)血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種起源于造血干細(xì)胞的克隆性惡性血液病，其疾病發(fā)生及進(jìn)展與機(jī)體免疫功能紊亂緊密相關(guān)[1]。目前臨床對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，普遍認(rèn)為本病是多種因素共同作用的結(jié)果；既往研究指出T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要組成部分，在預(yù)防腫瘤中發(fā)揮重要作用[2]。而Tim-3是近年來(lái)才被關(guān)注的重要負(fù)性共刺激分子，屬于Tim基因家族成員之一，有研究指出Tim-3及其配體參與了初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，與疾病活動(dòng)性存在明顯相關(guān)性[3]，另一研究指出Tim-3及其配體可通過(guò)負(fù)調(diào)控Th1細(xì)胞功能，推出Tim-3廣泛參與特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中，因而臨床可考慮Tim-3在評(píng)估急性白血病患者診治中可能具有一定應(yīng)用價(jià)值[4]。為此筆者對(duì)急性白血病治療前后外周血Tim-3表達(dá)水平變化及其臨床意義進(jìn)行探究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015年2月至2017年3月我院收治的25例初發(fā)急性白血病患者(研究組)，男13例，女12例，年齡16～70歲[(46.25±10.32)歲]，體重32～50 kg[(42.57±5.27)kg]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]有關(guān)急性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次確診為急性白血??；③未合并其它血液性疾??；④符合赫爾辛基宣言，自愿簽署相關(guān)知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期及哺乳期婦女；②既往有急性白血病史；③合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；④納入研究前經(jīng)過(guò)藥物治療；⑤對(duì)本研究依從性不高者。選取同期我院體檢的25例健康志愿者(健康組)，男14例，女11例，年齡18～70歲[(45.98±10.01)歲]，體重30～48 kg[(41.97±5.07)kg]。兩組基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治療方案 受試患者均行DA、MA等標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療，最終有23例患者達(dá)到完全緩解，2例自動(dòng)出院失訪。

1.2.2檢測(cè)方法 ①主要試劑及儀器：由天津瀚洋生物制品科技有限責(zé)任公司提供的淋巴細(xì)胞分離液，Trans Gen生物科技公司提供RNA抽提試劑Trizol和SuperMix cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，由美國(guó)R&D公司提供的人鼠抗人TIM-3抗體，美國(guó)AB公司提供SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)Master Mix試劑盒，選用GE醫(yī)療集團(tuán)提供的GeneQuan 1300/100紫外分光光度計(jì)，PCR儀及分析軟件由美國(guó)AB公司提供，美國(guó)BD公司提供給FACS Calibur流式細(xì)胞儀。②檢測(cè)步驟：選取納入研究對(duì)象外周靜脈血適量，選用乙二胺四乙酸抗凝，分別加入小鼠抗人單克隆抗體(藻紅蛋白-Cy5-CD3)、異硫氰酸熒光素(FITC)-CD4、藻紅蛋白-TIM-3，避光標(biāo)記20 min，待紅細(xì)胞裂解液孵育7 min后，注意避免振蕩；此外每管加入磷酸鹽緩沖液1 ml洗滌2次后，上機(jī)待檢，最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)受試對(duì)象外周血中Tim-3表達(dá)情況，同時(shí)采用Flowjo軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。③RNA提取及cDNA合成：取研究對(duì)象骨髓標(biāo)本，采用Ficoll密度梯度法將骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離，參照美國(guó)Invitrogen公司提供的TRIzol法提取總的RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳以確定RNA是否完整，采用紫外分光光度儀測(cè)定其吸光度(A)260/A280>1.8，并計(jì)算其RNA含量，采用100 ng六隨機(jī)引物、200U M-MLV 酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。④Tim-3基因檢測(cè)：采用SYBR Green I染料在ABI熒光定量PCR儀上檢測(cè)Tim-3基因的表達(dá)，PCR采用2步法進(jìn)行，反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃，10 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 退火延伸1 min，共循環(huán)40個(gè)，待反應(yīng)完畢后將擴(kuò)增每份PCR產(chǎn)物采用溶解曲線分析，并判斷是否為特異性產(chǎn)物，每個(gè)樣本的Tim-3及β-action mRNA的檢測(cè)均行3個(gè)平行管以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，最終取平均值，而目的基因相對(duì)表達(dá)水平采用2-△Ct計(jì)算，即△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.3觀察指標(biāo)①治療前后研究組與健康組外周T細(xì)胞Tim-3表達(dá)比較。②Tim-3基因PCR溶解產(chǎn)物特異性分析。③Tim-3基因在健康組及治療前后研究組骨髓中的表達(dá)。④急性白血病治療后的療效與Tim-3基因表達(dá)量的相關(guān)性分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Sperman相關(guān)性分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組外周血T細(xì)胞Tim-3表達(dá)比較研究組治療前外周血T細(xì)胞Tim-3表達(dá)高于治療后和健康組(P< 0.05)，研究組治療后外周血T細(xì)胞Tim-3表達(dá)與健康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血T細(xì)胞Tim-3表達(dá)比較

﹡與研究組治療前比較，P< 0.05

2.2Tim-3基因PCR溶解產(chǎn)物特異性分析溶解曲線顯示Tim-3基因和β-actin的PCR產(chǎn)物都呈較銳單峰，且溶解曲線中無(wú)其它雜峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性，無(wú)引物二聚體和非特異性產(chǎn)物；而隨機(jī)抽取的標(biāo)本的RT-q PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，而最終結(jié)果顯示都呈單一條帶，并且目的基因Tim-3與內(nèi)參基因β-actin的PCR產(chǎn)物分別位于75 pb及188 bp處，且無(wú)雜帶，進(jìn)一步表明反應(yīng)的特異性，見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)急性白血病患者Tim-3基因表達(dá) M：marker；a～d：急性白血病患者；e～f：健康者

2.3兩組骨髓中T細(xì)胞Tim-3mRNA表達(dá)比較研究組治療前Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于治療后和健康組(P< 0.05)；研究組治療后Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量與健康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組骨髓中T細(xì)胞Tim-3 mRNA表達(dá)比較

2.4急性白血病治療后的療效與Tim-3基因表達(dá)量的相關(guān)性分析Sperman相關(guān)性分析顯示，急性白血病患者臨床療效與Tim-3基因表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.987，P< 0.05)，與患者性別、年齡無(wú)相關(guān)性(P> 0.05)。

3 討論

急性白血病是由于造血干、祖細(xì)胞在較早階段發(fā)生增殖失控及凋亡受阻和分化障礙而引發(fā)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，患者經(jīng)過(guò)化療及骨髓抑制治療后其生存期得以有效延長(zhǎng)，但緩解后患者復(fù)發(fā)率仍較高，因而一直以來(lái)急性白血病死亡率仍居高不下[6]。急性白血病屬于一組形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及免疫分型和分子生物學(xué)等存在明顯差異的異質(zhì)性疾病，而白血病干細(xì)胞被認(rèn)為是急性白血病患者對(duì)化療藥物耐藥有一定關(guān)系。

Tim-3自2002年第一次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其作為重要的細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控因子，其可通過(guò)不同機(jī)制介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，在各類腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。如有學(xué)者研究指出Tim-3可異位表達(dá)于非造血細(xì)胞腫瘤細(xì)胞中，尤其是原發(fā)性癌細(xì)胞(如黑色素瘤、脂肪肉瘤、非小細(xì)胞肺癌及宮頸癌等)[8]；另有學(xué)者研究指出Tim-3在白血病干細(xì)胞中存在高表達(dá)現(xiàn)象[9]，國(guó)外學(xué)者的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明抗人Tim-3的鼠IgG2α抗體可在不損傷機(jī)體HSCs的同時(shí)阻止白血病細(xì)胞在小鼠體內(nèi)重建[10]，初步證實(shí)了Tim-3在急性白血病疾病發(fā)生、進(jìn)展等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示治療前研究組外周血T細(xì)胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于健康組及研究組治療后，而健康組外周血T細(xì)胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量與研究組治療后無(wú)顯著差異，還顯示Tim-3基因PCR產(chǎn)物反應(yīng)具有特異性，相關(guān)性分析顯示急性白血病患者臨床療效與Tim-3基因表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)，初步證實(shí)了Tim-3基因在急性白血病患者中存在高表達(dá)現(xiàn)象，體現(xiàn)出Tim-3在急性白血病的發(fā)生及進(jìn)展中具有明顯調(diào)節(jié)作用，與既往文獻(xiàn)報(bào)告相符[11]，且其表達(dá)水平高低在急性白血病患者臨床療效的評(píng)估中有著重要臨床意義，與早期學(xué)者研究指出Tim-3在胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)與患者預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)的結(jié)論相符[12]，此外國(guó)外學(xué)者研究還指出Tim-3在除了M3的大多數(shù)亞型急性白血病干細(xì)胞中高表達(dá)，但其在健康造血干細(xì)胞中幾乎不表達(dá)也表明了這一點(diǎn)[13]。本研究結(jié)果提示，在急性白血病患者免疫病理過(guò)程中，Tim-3可通過(guò)在T細(xì)胞的表達(dá)變化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，其可持續(xù)表達(dá)于CD4+、CD8+T細(xì)胞分裂階段，在第6個(gè)細(xì)胞周期達(dá)至峰值，因而Tim-3在急性白血病患者中存在高表達(dá)現(xiàn)象。

綜上，急性白血病治療前后外周血Tim-3表達(dá)水平存在明顯差異，Tim-3表達(dá)水平高低在急性白血病患者臨床療效評(píng)估中有著重要臨床意義。

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ExpressionlevelandsignificanceofTcellimmunoglobulinmucin3inperipheralbloodmononuclearcellsbeforeandaftertreatmentinpatientswithacuteleukemia

WUXiang-ling

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology，NorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637007，China)

ObjectiveTo investigate the expression level and significance of T cell immunoglobulin mucin 3 (Tim-3) in peripheral blood mononuclear cells before and after treatment in patients with acute leukemia.MethodsTwenty-five patients with acute leukemia treated in our hospital from February 2015 to March 2017 were selected as study group，and 25 healthy volunteers having physical examination or bone marrow of donors during the same period in our hospital were denoted as healthy group.After isolation of mononuclear cells，RNA was extracted and the patients were treated with standard chemotherapy.The expression level of Tim-3 mRNA in monocytes was detected by real-time qPCR.ResultsThe Tim-3 ratio in peripheral blood T cells and the relative expression level of Tim-3 mRNA in the study group before treatment were significantly higher than those in the healthy group and in the study group after treatment group (P< 0.05).The Tim-3 ratio in peripheral blood T cells and the relative expression of Tim-3 mRNA in the study group after treatment were not significantly different from those in the healthy group (P> 0.05).There was a negative correlation between clinical curative effect and expression levels of Tim-3 mRNA.ConclusionTim-3 gene is highly expressed in patients with acute leukemia.Its expression level plays a role in evaluation of the therapeutic effect of the patients.

Acute leukemia；Treatment；Tim-3；Clinical significance

川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：CBY15-A-ZD13)

R733.71

A

1672-6170(2017)05-0085-03

2017-03-21；

2017-05-23)