伍香玲

(川北醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室，四川 南充 637007)

急性白血病治療前后外周血單個核細胞T細胞免疫球蛋白黏蛋白3的表達水平及意義

伍香玲

(川北醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室，四川 南充 637007)

目的探討急性白血病治療前后外周血單個核細胞T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)的表達水平及意義。方法選取2015年2月至2017年3月我院收治的25例急性白血病患者(研究組)及同期我院體檢的25例健康志愿者及其供體的骨髓(健康組)，將單個核細胞分離后提取DNA，受試患者接受標準方案化療治療，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測單個核細胞上Tim-3 mRNA表達量。結果研究組治療前外周血T細胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對表達量明顯高于健康組及治療后(P< 0.05)；而研究組治療后外周血T細胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對表達量與健康組差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；急性白血病患者臨床療效與Tim-3基因表達量呈明顯負相關(P< 0.05)。結論Tim-3基因在急性白血病初治患者中存在明顯高表達現(xiàn)象，其表達水平高低在急性白血病患者治療效果的評估中有一定積極作用。

急性白血病；治療；Tim-3；臨床意義

急性白血病為臨床常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種起源于造血干細胞的克隆性惡性血液病，其疾病發(fā)生及進展與機體免疫功能紊亂緊密相關[1]。目前臨床對其發(fā)病機制尚未完全明確，普遍認為本病是多種因素共同作用的結果；既往研究指出T淋巴細胞和自然殺傷細胞是機體細胞免疫的重要組成部分，在預防腫瘤中發(fā)揮重要作用[2]。而Tim-3是近年來才被關注的重要負性共刺激分子，屬于Tim基因家族成員之一，有研究指出Tim-3及其配體參與了初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的細胞免疫調節(jié)，與疾病活動性存在明顯相關性[3]，另一研究指出Tim-3及其配體可通過負調控Th1細胞功能，推出Tim-3廣泛參與特異性免疫應答的調節(jié)中，因而臨床可考慮Tim-3在評估急性白血病患者診治中可能具有一定應用價值[4]。為此筆者對急性白血病治療前后外周血Tim-3表達水平變化及其臨床意義進行探究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015年2月至2017年3月我院收治的25例初發(fā)急性白血病患者(研究組)，男13例，女12例，年齡16～70歲[(46.25±10.32)歲]，體重32～50 kg[(42.57±5.27)kg]。納入標準：①符合《血液病診斷及療效標準》[5]有關急性白血病診斷標準；②初次確診為急性白血?。虎畚春喜⑵渌盒约膊。虎芊虾諣栃粱?，自愿簽署相關知情同意書。排除標準：①妊娠期及哺乳期婦女；②既往有急性白血病史；③合并嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；④納入研究前經(jīng)過藥物治療；⑤對本研究依從性不高者。選取同期我院體檢的25例健康志愿者(健康組)，男14例，女11例，年齡18～70歲[(45.98±10.01)歲]，體重30～48 kg[(41.97±5.07)kg]。兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治療方案 受試患者均行DA、MA等標準化療方案治療，最終有23例患者達到完全緩解，2例自動出院失訪。

1.2.2檢測方法 ①主要試劑及儀器：由天津瀚洋生物制品科技有限責任公司提供的淋巴細胞分離液，Trans Gen生物科技公司提供RNA抽提試劑Trizol和SuperMix cDNA反轉錄試劑盒，由美國R&D公司提供的人鼠抗人TIM-3抗體，美國AB公司提供SYBR Green聚合酶鏈反應Master Mix試劑盒，選用GE醫(yī)療集團提供的GeneQuan 1300/100紫外分光光度計，PCR儀及分析軟件由美國AB公司提供，美國BD公司提供給FACS Calibur流式細胞儀。②檢測步驟：選取納入研究對象外周靜脈血適量，選用乙二胺四乙酸抗凝，分別加入小鼠抗人單克隆抗體(藻紅蛋白-Cy5-CD3)、異硫氰酸熒光素(FITC)-CD4、藻紅蛋白-TIM-3，避光標記20 min，待紅細胞裂解液孵育7 min后，注意避免振蕩；此外每管加入磷酸鹽緩沖液1 ml洗滌2次后，上機待檢，最后采用流式細胞儀檢測受試對象外周血中Tim-3表達情況，同時采用Flowjo軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析處理。③RNA提取及cDNA合成：取研究對象骨髓標本，采用Ficoll密度梯度法將骨髓單個核細胞分離，參照美國Invitrogen公司提供的TRIzol法提取總的RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳以確定RNA是否完整，采用紫外分光光度儀測定其吸光度(A)260/A280>1.8，并計算其RNA含量，采用100 ng六隨機引物、200U M-MLV 酶反轉錄為cDNA。④Tim-3基因檢測：采用SYBR Green I染料在ABI熒光定量PCR儀上檢測Tim-3基因的表達，PCR采用2步法進行，反應條件設定為95 ℃，10 min預變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 退火延伸1 min，共循環(huán)40個，待反應完畢后將擴增每份PCR產(chǎn)物采用溶解曲線分析，并判斷是否為特異性產(chǎn)物，每個樣本的Tim-3及β-action mRNA的檢測均行3個平行管以確保結果的準確性，最終取平均值，而目的基因相對表達水平采用2-△Ct計算，即△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。

1.3觀察指標①治療前后研究組與健康組外周T細胞Tim-3表達比較。②Tim-3基因PCR溶解產(chǎn)物特異性分析。③Tim-3基因在健康組及治療前后研究組骨髓中的表達。④急性白血病治療后的療效與Tim-3基因表達量的相關性分析。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；相關分析采用Sperman相關性分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1兩組外周血T細胞Tim-3表達比較研究組治療前外周血T細胞Tim-3表達高于治療后和健康組(P< 0.05)，研究組治療后外周血T細胞Tim-3表達與健康組比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，見表1。

表1 兩組外周血T細胞Tim-3表達比較

﹡與研究組治療前比較，P< 0.05

2.2Tim-3基因PCR溶解產(chǎn)物特異性分析溶解曲線顯示Tim-3基因和β-actin的PCR產(chǎn)物都呈較銳單峰，且溶解曲線中無其它雜峰，表明擴增產(chǎn)物具有特異性，無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物；而隨機抽取的標本的RT-q PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，而最終結果顯示都呈單一條帶，并且目的基因Tim-3與內參基因β-actin的PCR產(chǎn)物分別位于75 pb及188 bp處，且無雜帶，進一步表明反應的特異性，見圖1。

圖1 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測急性白血病患者Tim-3基因表達 M：marker；a～d：急性白血病患者；e～f：健康者

2.3兩組骨髓中T細胞Tim-3mRNA表達比較研究組治療前Tim-3 mRNA相對表達量高于治療后和健康組(P< 0.05)；研究組治療后Tim-3 mRNA相對表達量與健康組比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，見表2。

表2 兩組骨髓中T細胞Tim-3 mRNA表達比較

2.4急性白血病治療后的療效與Tim-3基因表達量的相關性分析Sperman相關性分析顯示，急性白血病患者臨床療效與Tim-3基因表達量呈明顯負相關(r=-0.987，P< 0.05)，與患者性別、年齡無相關性(P> 0.05)。

3 討論

急性白血病是由于造血干、祖細胞在較早階段發(fā)生增殖失控及凋亡受阻和分化障礙而引發(fā)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，患者經(jīng)過化療及骨髓抑制治療后其生存期得以有效延長，但緩解后患者復發(fā)率仍較高，因而一直以來急性白血病死亡率仍居高不下[6]。急性白血病屬于一組形態(tài)學、細胞遺傳學及免疫分型和分子生物學等存在明顯差異的異質性疾病，而白血病干細胞被認為是急性白血病患者對化療藥物耐藥有一定關系。

Tim-3自2002年第一次被發(fā)現(xiàn)以來，其作為重要的細胞免疫負調控因子，其可通過不同機制介導腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，在各類腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移中發(fā)揮重要作用[7]。如有學者研究指出Tim-3可異位表達于非造血細胞腫瘤細胞中，尤其是原發(fā)性癌細胞(如黑色素瘤、脂肪肉瘤、非小細胞肺癌及宮頸癌等)[8]；另有學者研究指出Tim-3在白血病干細胞中存在高表達現(xiàn)象[9]，國外學者的動物實驗研究表明抗人Tim-3的鼠IgG2α抗體可在不損傷機體HSCs的同時阻止白血病細胞在小鼠體內重建[10]，初步證實了Tim-3在急性白血病疾病發(fā)生、進展等病理過程中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示治療前研究組外周血T細胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對表達量高于健康組及研究組治療后，而健康組外周血T細胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相對表達量與研究組治療后無顯著差異，還顯示Tim-3基因PCR產(chǎn)物反應具有特異性，相關性分析顯示急性白血病患者臨床療效與Tim-3基因表達量呈明顯負相關，初步證實了Tim-3基因在急性白血病患者中存在高表達現(xiàn)象，體現(xiàn)出Tim-3在急性白血病的發(fā)生及進展中具有明顯調節(jié)作用，與既往文獻報告相符[11]，且其表達水平高低在急性白血病患者臨床療效的評估中有著重要臨床意義，與早期學者研究指出Tim-3在胃癌細胞中的高表達與患者預后呈明顯負相關的結論相符[12]，此外國外學者研究還指出Tim-3在除了M3的大多數(shù)亞型急性白血病干細胞中高表達，但其在健康造血干細胞中幾乎不表達也表明了這一點[13]。本研究結果提示，在急性白血病患者免疫病理過程中，Tim-3可通過在T細胞的表達變化，調節(jié)機體免疫反應，其可持續(xù)表達于CD4+、CD8+T細胞分裂階段，在第6個細胞周期達至峰值，因而Tim-3在急性白血病患者中存在高表達現(xiàn)象。

綜上，急性白血病治療前后外周血Tim-3表達水平存在明顯差異，Tim-3表達水平高低在急性白血病患者臨床療效評估中有著重要臨床意義。

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ExpressionlevelandsignificanceofTcellimmunoglobulinmucin3inperipheralbloodmononuclearcellsbeforeandaftertreatmentinpatientswithacuteleukemia

WUXiang-ling

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology，NorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637007，China)

ObjectiveTo investigate the expression level and significance of T cell immunoglobulin mucin 3 (Tim-3) in peripheral blood mononuclear cells before and after treatment in patients with acute leukemia.MethodsTwenty-five patients with acute leukemia treated in our hospital from February 2015 to March 2017 were selected as study group，and 25 healthy volunteers having physical examination or bone marrow of donors during the same period in our hospital were denoted as healthy group.After isolation of mononuclear cells，RNA was extracted and the patients were treated with standard chemotherapy.The expression level of Tim-3 mRNA in monocytes was detected by real-time qPCR.ResultsThe Tim-3 ratio in peripheral blood T cells and the relative expression level of Tim-3 mRNA in the study group before treatment were significantly higher than those in the healthy group and in the study group after treatment group (P< 0.05).The Tim-3 ratio in peripheral blood T cells and the relative expression of Tim-3 mRNA in the study group after treatment were not significantly different from those in the healthy group (P> 0.05).There was a negative correlation between clinical curative effect and expression levels of Tim-3 mRNA.ConclusionTim-3 gene is highly expressed in patients with acute leukemia.Its expression level plays a role in evaluation of the therapeutic effect of the patients.

Acute leukemia；Treatment；Tim-3；Clinical significance

川北醫(yī)學院科研發(fā)展重點項目(編號：CBY15-A-ZD13)

R733.71

A

1672-6170(2017)05-0085-03

2017-03-21；

2017-05-23)