彭端亮，劉成桂，繆曉燕，劉于嵩，宋 建，錢金鳳

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)檢驗(yàn)科，四川 成都 610101；2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610091)

Taqman定量PCR檢測(cè)宮頸癌樣本中CXCL12和CXCR4基因表達(dá)水平

彭端亮1，劉成桂2，繆曉燕1，劉于嵩1，宋 建1，錢金鳳1

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)檢驗(yàn)科，四川 成都 610101；2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610091)

目的探討CXCL12和CXCR4基因檢測(cè)在宮頸癌病變篩查中對(duì)宮頸癌早期診斷及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測(cè)的效果。方法選擇2015年1月至2016年9月在我院婦產(chǎn)科就診的宮頸癌患者113例為癌癥組，另選同期正常宮頸組織20例作為正常對(duì)照。觀察不同病理分型中CXCL12和CXCR4檢測(cè)結(jié)果，以及CXCL12和CXCR4 mRNA檢測(cè)準(zhǔn)確性、特異性以及重復(fù)性等指標(biāo)，分析不同臨床病理指標(biāo)的宮頸癌樣本和正常宮頸樣本中CXCL12和CXCR4 mRNA的表達(dá)量的變化。結(jié)果多重?zé)晒舛矿w系的準(zhǔn)確性、特異性和檢測(cè)線性結(jié)果均滿足設(shè)計(jì)要求，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法評(píng)估試劑的重復(fù)性。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性梯度和重復(fù)性。對(duì)實(shí)際臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定宮頸癌組織中CXCR4 mRNA表達(dá)量和正常組織中上調(diào)明顯，2-ΔCt等于或大于(3.01±0.09)，不同臨床分型結(jié)果或者腫瘤病理類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；而當(dāng)淋巴結(jié)組織中出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的情況下，CXCL12的下調(diào)至(0.09±0.02)，與無淋巴組織轉(zhuǎn)移的腫瘤(0.19±0.2)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。結(jié)論CXCL12和CXCR4可以作為早期生物標(biāo)志物，可以在宮頸癌早期檢測(cè)中發(fā)揮重要作用，采用熒光定量PCR方法結(jié)合2-ΔCt計(jì)算方法具有理想的效果，適合臨床進(jìn)一步研究和推廣。

宮頸癌；CXCL12；CXCR4；基因表達(dá)；熒光定量PCR

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，高發(fā)年齡為50～55歲，嚴(yán)重影響女性健康[1]，近年來發(fā)病有年輕化趨勢(shì)[2]。目前普遍認(rèn)為高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染時(shí)發(fā)展成宮頸癌的主要因素，但目前并沒有針對(duì)高危型人乳頭瘤病毒的有效治療手段，所以通過宮頸細(xì)胞學(xué)篩查，使宮頸癌和癌前病變得以早期發(fā)現(xiàn)和治療，依舊是降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率的有效途徑。最近，腫瘤標(biāo)志物的研究越來越被研究人員重視，是可以有效提示腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)[3]。研究表明，腫瘤組織中，特別是在細(xì)胞浸潤(rùn)的邊緣——趨化因子受體系統(tǒng)表達(dá)出現(xiàn)明顯的變化，并且這種變化出現(xiàn)在組織內(nèi)絕大部分的腫瘤細(xì)胞中[4]，趨化因子是一類能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子堿性蛋白，迄今已發(fā)現(xiàn)40多種人的趨化因子，根據(jù)半胱氨酸的位置不同可以分為C、CC、CXC和CX3C四個(gè)亞族。趨化因子及其受體在人體內(nèi)作用十分廣泛，他們不僅對(duì)白細(xì)胞具有趨化作用，并且再炎癥反應(yīng)、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等方面都發(fā)揮著廣泛的作用。其中趨化因子CXCL12及其受體CXCR4可以通過激活多種信號(hào)通路的方式在腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤血管生長(zhǎng)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為中起重要作用[5]，越來越受到研究者的重視，可以成為理想的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

目前國(guó)內(nèi)外主要采用熒光染料法對(duì)CXCR12或CXCR4基因進(jìn)行檢測(cè)[6～8]，由于熒光染料的原因，至少需要3管(CXCR12，CXCR4和內(nèi)參基因)擴(kuò)增體系，操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且成本較高，所以為了解決這個(gè)問題，本文擬通過設(shè)計(jì)CXCL12和CXCR4的單管三重Taqman熒光定量PCR體系對(duì)宮頸癌組織中CXCL12和CXCR4基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討CXCL12和CXCR4作為宮頸癌早期診斷腫瘤標(biāo)記物的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2015年1月至2016年9月在我院婦產(chǎn)科就診的宮頸癌患者113例為癌癥組(I A1期14例，I A2期23例，I B2期25例，II A1期30例，II A2期21例)，年齡(49±5)歲；子宮頸癌分期根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第八版進(jìn)行臨床分期[10]。另選同期正常宮頸組織20例作為正常對(duì)照。入選病例均不伴有其他惡性腫瘤疾病。

1.2主要試劑和儀器Hela細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自存，GAPDH、CXCL12和CXCR4基因假病毒購自蘇州金唯智生物科技有限公司，Trizol Reagent購自美國(guó)Invitrogen公司。superscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermofisher公司。ABI 7500熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1PCR反應(yīng)引物及探針的設(shè)計(jì) CXCR4基因、CXCL12基因和內(nèi)參基因的引物和熒光檢測(cè)探針采用primer5軟件，根據(jù)NCBI上下載的人CXCL12和CXCR4基因下載的序列設(shè)計(jì)，引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成，核苷酸序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，見表1。熒光定量PCR體系及反應(yīng)條件。

表1 引物探針序列

1.3.2總RNA的提取 取冷凍保存的宮頸癌組織和正常宮頸組織0.1～0.2 g，采用Trizol法提取組織RNA，操作嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。

1.3.3一步法逆轉(zhuǎn)錄定量PCR PCR反應(yīng)采用一步法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系體積為50 μl，包含1×superscrpt buffer，引物(各8 pmol)，熒光探針(各4 pmol)，5 μl RNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50 ℃ 15 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 共50個(gè)循環(huán)。

1.4構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線以采購的CXCL12和CXCR4基因假病毒為標(biāo)準(zhǔn)品，使用確定濃度的人基因組(10 ng/μl)進(jìn)行梯度稀釋[體積比為105copies/ μl]，共稀釋5個(gè)梯度，以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR，以ΔCt[Ct(target gene)-Ct(GAPDH)]為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，制作得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.52-ΔCt法對(duì)CXCR12和CXCR14基因的表達(dá)水平通過相對(duì)定量的方法進(jìn)行計(jì)算，采用目的基因與內(nèi)參基因之間Ct值之間的差異來確定目的基因的表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)中，以GAPDH作為內(nèi)參基因，所以，每一個(gè)樣本的ΔCt=Ct(target gene)-Ct(GAPDH)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間CXCR4和CXCR12 mRNA表達(dá)的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1熒光定量PCR體系的驗(yàn)證

2.1.1引物探針檢測(cè)準(zhǔn)確性及特異性 將三種不同基因的引物和探針配置成單管單重體系，對(duì)三種基因的假病毒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示三種基因的引物和探針均可以特異性檢出對(duì)應(yīng)假病毒的結(jié)果，而對(duì)于其它假病毒檢測(cè)并未出現(xiàn)非特異曲線，見圖1a。

圖1 熒光定量體系驗(yàn)證結(jié)果 a：CXCR4引物驗(yàn)證結(jié)果，四個(gè)梯度下，擴(kuò)增曲線呈線性關(guān)系，CXCL12和GAPDH未見擴(kuò)增曲線；b：多重?zé)晒怏w系檢測(cè)結(jié)果，三個(gè)基因出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線

2.1.2多重?zé)晒舛縋CR 將三種不同基因的引物和探針配置成單管多重PCR體系，對(duì)三種假病毒及Hela細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示三種假病毒檢測(cè)準(zhǔn)確性和特異性未發(fā)生變化，但Ct值有所下降，而Hela細(xì)胞結(jié)果顯示，三個(gè)熒光通道均出現(xiàn)熒光曲線，表明多重?zé)晒舛縋CR體系檢測(cè)準(zhǔn)確性和特異性效果良好，見圖1b。

2.1.3檢測(cè)線性 對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋，對(duì)稀釋的樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，單管多重體系檢測(cè)線性良好，相同梯度稀釋下Ct值變化成線性關(guān)系變化，目的基因與管家基因之間2-ΔCt值變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 線性檢測(cè)結(jié)果 a:CXCR4結(jié)果;b:CXCL12結(jié)果;c:GAPDH結(jié)果

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)人工合成的CXCL12和CXCR4濃度梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定，因本實(shí)驗(yàn)采用ΔCt法，不計(jì)算絕對(duì)含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線用于評(píng)估試劑的重復(fù)性。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性梯度和重復(fù)性，R2= 0.9966，見圖3。

圖3 CXCL12基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的可行性和重復(fù)性

2.3熒光定量PCR檢測(cè)CXCL12基因在宮頸組織中mRNA表達(dá)結(jié)果由表2可見，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中CXCL12 mRNA表達(dá)水平與正常組織表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中CXCL12 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

表2 宮頸癌患者盆腔淋巴結(jié)組織中CXCL12基因mRNA表達(dá)水平比較

﹡與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，P< 0.05

2.4熒光定量PCR檢測(cè)CXCR4基因在宮頸組織中mRNA表達(dá)結(jié)果與CXCL12基因不同，CXCR4基因在正常組織和宮頸癌組織中mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，同時(shí)，宮頸癌出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，CXCR4基因的表達(dá)量出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的情況更加明顯(P< 0.05)，見表3。

表3 不同臨床病理指標(biāo)的宮頸癌患者癌組織中CXCR4基因表達(dá)水平的比較

﹡與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，P< 0.05

3 討論

趨化因子CXCL12，是趨化因子家族中被研究最多的成員之一[11～14]，在許多組織中表達(dá)，參與多種生理發(fā)育過程。CXCR4是CXCL12的受體，與其一同構(gòu)成CXCL12-CXCR4生物學(xué)軸，通過激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和侵襲能力，從而參與惡性腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中，與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展有密切的關(guān)系。已有研究表明CXCL12和CXCR4基因mRNA的表達(dá)水平與子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展具有相關(guān)性，是潛在的腫瘤標(biāo)志物。

目前國(guó)內(nèi)外文章中主要采用溶解曲線法對(duì)腫瘤組織內(nèi)的CXCL12和CXCR4基因進(jìn)行檢測(cè)，如果需要同時(shí)對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)分析，則需要三管擴(kuò)增體系(CXCR12，CXCR4和內(nèi)參基因)，操作較為繁瑣，并且擴(kuò)增過程中也可能因?yàn)閮x器不同區(qū)域溫度誤差、人為操作等因素導(dǎo)致結(jié)果分析出現(xiàn)不必要的誤差，而采用Taqman探針[15～17]可以選擇多種熒光標(biāo)記物，采用多重?cái)U(kuò)增檢測(cè)的方法在一管體系中同時(shí)檢測(cè)CXCL12和CXCR4兩種目的基因和內(nèi)參基因，避免因?yàn)閮x器原因而導(dǎo)致的誤差以及更加節(jié)約成本。本文通過采用FAM，Hex和CY3三種熒光標(biāo)記物標(biāo)記在三個(gè)基因的特異性熒光探針上，制備成單管三種熒光定量PCR體系，可以同時(shí)檢測(cè)CXCL12，CXCR4和內(nèi)參基因(GAPDH基因)。通過Hela細(xì)胞作為樣本的測(cè)試結(jié)果表明，該體系的檢測(cè)效果好，檢測(cè)線性、特異性等性能均滿足實(shí)驗(yàn)要求。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法對(duì)試劑和儀器的重復(fù)性和可靠性進(jìn)行檢測(cè)，可以知道試劑呈現(xiàn)良好的線性梯度和重復(fù)性，適合臨床應(yīng)用的需求。

本研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4基因在正常宮頸樣本及宮頸癌組織樣本中表達(dá)水平有明顯的不同，并且宮頸癌組織樣本中，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織CXCR4基因mRNA表達(dá)量相較未出現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)量上調(diào)更加明顯，而CXCR4表達(dá)量與病理分級(jí)，病理類型等指標(biāo)相關(guān)性不大，說明CXCR4基因的高表達(dá)可以成為是否有腫瘤發(fā)生以及是否轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)。于此同時(shí)，CXCL12基因在有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織相較無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中出現(xiàn)了表達(dá)水平明顯下調(diào)的情況，而在宮頸癌組織中表達(dá)量未出現(xiàn)明顯變化，這個(gè)結(jié)果與Muller等[14]研究的乳腺癌最常見轉(zhuǎn)移部位CXCL12表達(dá)變化相類似，這個(gè)f結(jié)果表明CXCL12基因可以作為很好的是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的。綜合以上結(jié)果可以看出，針對(duì)宮頸及周圍盆腔淋巴結(jié)組織中的CXCL12及CXCR4基因mRNA進(jìn)行檢測(cè)，可以較好的作為宮頸癌是否存在以及是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的很好的指標(biāo)。對(duì)臨床樣本進(jìn)行熒光定量分析，并采用2-ΔCt的計(jì)算方法進(jìn)行分析，當(dāng)CXCR4基因2-ΔCt等于或大于(3.01±0.09)時(shí)，高度懷疑宮頸癌的出現(xiàn)，而當(dāng)淋巴結(jié)組織中出現(xiàn)CXCL12表達(dá)量低于(0.09±0.02)時(shí)，表明出現(xiàn)淋巴結(jié)組織轉(zhuǎn)移的可能性增大。

總之，本研究設(shè)計(jì)的單管多重Taqman熒光定量PCR試劑可以很好的檢測(cè)出CXCL12和CXCR4基因在宮頸癌組織及盆腔淋巴結(jié)組織中的表達(dá)量，并且通過分析CXCL12和CXCR4基因的表達(dá)量可以作為子宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的很好的腫瘤標(biāo)志物。

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TheexpressionsofCXCL12andCXCR4incervicalcancerdeterminedbyusingTaqmanreal-timePCR

PENGDuan-liang1，LIUCheng-gui2，MIUXiao-yan1，LIUYu-song1，SONGJian1，QIANJin-feng1

(1.ClinicalLaboratory，EastBranch，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu6101012，China；2.ChengduWomen&Children’sCentralHospital，Chengdu610091，China)

ObjectiveTo investigate the effect of detection of mRNA expression levels of CXCL12 and CXCR4 in early diagnosis and lymphatic metastatic diagnosis of cervical cancer.MethodsFrom January 2015 to September 2016，113 patients with cervical cancer treated at department of gynecology and obstetrics were taken as cancer group.Meanwhile，20 patients with healthy cervical tissue were taken as control group.The results of CXCL12 and CXCR4 in different pathological types，and the accuracy，specificity and repeatability of the detection of mRNA expression of CXCL12 and CXCR4 were observed.The changes of CXCL12 and CXCR4 mRNA expressions between the cervical cancer samples and normal cervical tissues as well as among the various clinicopathological parameters were compared.ResultsThe accuracy，specificity and measuring linearity of Taqman real-time PCR met the design requirements.Standard curve results showed good repeatability.In cervical cancer tumor，the expression levels of CXCR4 mRNA were increased (2-ΔCt= 3.01 ± 0.09).However，there was no significant difference in CXCR4 mRNA expression among clinical stages and pathological patterns (P> 0.05).When the tumor was metastatic，the expression levels of CXCL12 mRNA were reduced (2-ΔCt= 0.09 ± 0.02) that was significantly lower than that in cancer without metastasis (2-ΔCt= 0.19 ± 0.20) (P< 0.05).ConclusionCXCL12 and CXCR4 could be used as biomarkers that may play an important role in early diagnosis of cervical cancer.The real time PCR combined the calculation method of 2-ΔCtcould reach idea results that will be suitable for clinical further promotion.

Cervical cancer；CXCL12；CXCR4；Expression；real-time PCR

R446.11；R737.33

A

1672-6170(2017)05-0016-04

2017-03-21；

2017-05-23)