林艷艷， 楊雪梅， 楊云貴

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院， 陜西 楊凌712100)

草地早熟禾(Poapratensis)是常用的草坪草種，他具有根莖發(fā)達(dá)、分蘗能力極強(qiáng)、青綠期長等優(yōu)良性狀，能迅速形成密而整齊的草坪，但其對鹽脅迫敏感[1]，所以目前對草地早熟禾的研究主要集中在鹽堿脅迫及水肥管理等方面[2]。

伴隨著工業(yè)化的發(fā)展，土壤重金屬污染程度日益加重，其中金屬鎘(Cd)污染不僅具有不可逆性、持久性，且毒性大，難降解，污染面積大[3-4]。根據(jù)2014年國家環(huán)保部門發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，金屬Cd的污染位于無機(jī)污染物點(diǎn)位超標(biāo)率之首。金屬Cd污染對農(nóng)田及林地的影響受關(guān)注度較高，但對草坪的影響并未引起廣泛的重視，因此文章針對Cd污染對草地早熟禾的影響設(shè)計(jì)試驗(yàn)。另外據(jù)聯(lián)合國教科文組織(UNESCO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)不完全統(tǒng)計(jì)[5]，全世界鹽漬土面積約為 9.543 8億 hm2，而鹽漬土地主要分布在世界各地的干旱、半干旱地區(qū)[6-7]，陜西省大部分地區(qū)均屬于干旱半干旱地區(qū)，降水量少，且水分蒸發(fā)量大。

五氨基乙酰丙酸(5-ALA)普遍存在于動、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)，是生物體內(nèi)葉綠素、血紅素和維生素B12等物質(zhì)合成前體[8]。但5-ALA的效果發(fā)揮程度很大程度取決于5-ALA的施用濃度、方式、時(shí)間及作物種類[9]。當(dāng)?shù)蜐舛鹊?-ALA作用于根后表現(xiàn)為減少作物根系對Na+、K+的吸收，促進(jìn)對N、P、Mg及Fe等的吸收[10]。噴施適宜濃度的5-ALA能促進(jìn)低溫脅迫下煙草(NicotianatabacumL.)可溶性糖和游離脯氨酸的積累,減緩葉綠素含量的下降,降低煙草葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量，從而提高煙草植株的抗寒能力[11]。

綜上所述，本試驗(yàn)探討了草地早熟禾生長在Cd，NaCl和PEG脅迫的環(huán)境中時(shí)，外源噴施5-ALA對草地早熟禾生長產(chǎn)生的影響，最終提供一種保護(hù)草地早熟禾草坪的科學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用草地早熟禾‘午夜’品種為材料，種子2015年10月購于江蘇沭陽縣卓天花卉園藝場。

1.2 試驗(yàn)方法

用0.5%的NaClO溶液泡種子10 min進(jìn)行消毒[12]，浸泡后用自來水反復(fù)沖洗數(shù)次，再用蒸餾水清洗3次。

晾干后，將種子放在以雙層濾紙為發(fā)芽床的培養(yǎng)皿內(nèi)，皿內(nèi)事先分別加蒸餾水(無脅迫)、100 mmol·L-1的NaCl、2 mg·L-1的Cd及15%PEG逆境處理液5 mL，每種處理液內(nèi)分別添加不同濃度的5-ALA(0，5，25，50，100 mg·L-1)。每皿內(nèi)放置100粒種子，每個(gè)處理3次重復(fù)，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，培養(yǎng)條件：溫度為晝夜25℃，光照8 h，每天稱重補(bǔ)水，每隔3天更換1次濾紙及逆境處理溶液。每天觀察發(fā)芽情況，記錄發(fā)芽種子的數(shù)量，連續(xù)觀察萌發(fā)情況到不再變化為止。

1.3 試驗(yàn)測定指標(biāo)

可溶性蛋白的測定：待14天發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，第16天稱取幼苗0.02 g，放入預(yù)冷的研缽中，加入少量石英砂及1 mL蒸餾水研磨充分，并用2 mL蒸餾水將研缽洗凈合并提取液轉(zhuǎn)入離心管中，于5 000 g轉(zhuǎn)速下離心10 min，之后取上清液0.1 mL，加入0.9 mL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，放置2 min在595 nm波長下比色，記錄吸光值，根據(jù)方程計(jì)算可溶性蛋白含量[13]。用Synergy HT多功能酶標(biāo)儀測定吸光值，具體操作為，從每個(gè)待測混合液中用移液槍抽取200 μL，加入到96孔酶標(biāo)板中，然后放入酶標(biāo)儀中測定。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)的含量(μg·g-1FW)=C*Vt·FW-1*Vs-1

式中，C：查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg)；Vt：提取液總體積；Vs：測定時(shí)加樣量(mL)；FW：樣品鮮重(g)。

每天記錄各培養(yǎng)皿的發(fā)芽狀況，直到第14天結(jié)束發(fā)芽試驗(yàn)，在發(fā)芽結(jié)束后從各培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取10株幼苗測定根長和芽長，并計(jì)算發(fā)芽勢(%)、發(fā)芽率(%)、芽長、根長、芽促進(jìn)率(%)、根促進(jìn)率(%)。

發(fā)芽率=n14/M×100%

發(fā)芽勢=n7/M×100%

芽促進(jìn)率=(處理芽長-對照芽長)/對照芽長×100%

根促進(jìn)率=(處理根長-對照根長)/對照根長×100%

公式中，n7,n14分別為發(fā)芽第7天和第14天的發(fā)芽種子數(shù)，M為供試種子總數(shù)(100粒)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理和制圖；采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，研究同一脅迫下不同濃度5-ALA對草地早熟禾種子萌發(fā)及幼苗生長之間的差異關(guān)系，用Duncan’s進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾種子萌發(fā)的影響

由圖1、圖2可知，5，25 mg·L-1的5-ALA對不同脅迫下早熟禾的發(fā)芽勢和發(fā)芽率大致呈促進(jìn)趨勢，而50，100 mg·L-1的5-ALA對發(fā)芽率發(fā)芽勢呈抑制狀態(tài)或差異不顯著。當(dāng)無脅迫(H2O)存在時(shí)0，5，25 mg·L-1的5-ALA對發(fā)芽勢(66%，70.7%，68%)發(fā)芽率(81.7%，79.3%，85.7%)的效應(yīng)不存在顯著差異，而50，100 mg·L-1的5-ALA顯著(P<0.05)抑制發(fā)芽勢(42. 7%，70%)和發(fā)芽率(13. 7%，54%)。2 mg·L-1的Cd脅迫下，5，25 mg·L-15-ALA顯著(P<0.05)提高了種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率；當(dāng)5-ALA濃度為 50 mg·L-1時(shí)對發(fā)芽勢有顯著(P<0.05)抑制作用，發(fā)芽勢降到23.3%，而對發(fā)芽率有顯著(P<0.05)促進(jìn)作用；當(dāng)5-ALA濃度為100 mg·L-1時(shí)對發(fā)芽勢亦有顯著(P<0.05)抑制作用，而對發(fā)芽率的影響和組內(nèi)對照相比差異不顯著。

100 mmol·L-1的NaCl脅迫下，添加5，25，50 mg·L-1的5-ALA與對照相比均顯著(P<0.05)提高了種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率，此3種濃度的5-ALA作用效果之間差異不顯著，但50 mg·L-1的5-ALA促進(jìn)作用高于5，25 mg·L-1；當(dāng)5-ALA濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，無論對發(fā)芽勢還是發(fā)芽率與組內(nèi)對照相比均不存在顯著差異。15%PEG脅迫下，5，50，100 mg·L-1的5-ALA對發(fā)芽勢的影響不存在顯著差異；而當(dāng)5-ALA 濃度為25 mg·L-1時(shí)發(fā)芽勢顯著(P<0.05)提高到33%，比對照提高16.3%，但對發(fā)芽率無明顯作用。

圖1 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾種子發(fā)芽勢的影響Fig.1 Effects of 5-ALA on germination energy of Poa pratensis under different stress treatments

圖2 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾種子發(fā)芽率的影響Fig.2 Effects of 5-ALA on germination rate of Poa pratensis under different stress treatments

2.2 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗芽長、根長的影響

通過比較不同濃度5-ALA對不同脅迫下種子萌發(fā)狀況的影響可以發(fā)現(xiàn)，在無脅迫時(shí)，5 mg·L-1的5-ALA對芽長的促進(jìn)作用不顯著；25 mg·L-1的5-ALA能顯著促進(jìn)幼苗芽的生長(P<0.05)，其芽長比對照長0.43 cm；而50，100 mg·L-1的5-ALA對芽長有顯著抑制效應(yīng)(P<0.05)，其中100 mg·L-1的抑制作用強(qiáng)，其芽長比對照短1.31 cm。在2 mg·L-1Cd脅迫下，未添加5-ALA的一組芽長(1.92cm)顯著比無脅迫條件下芽長(0.71 cm)短；當(dāng)添加了5，25，50 mg·L-15-ALA后Cd對芽長的抑制作用顯著(P<0.05)得到緩解，其中25 mg·L-1的緩解作用最強(qiáng)，芽長可達(dá)到2.01 cm。100 mmol·L-1的NaCl脅迫下芽長的變化與Cd相似(圖3)。

15%PEG脅迫下，添加5，25 mg·L-15-ALA均能顯著(P<0.05)增加芽長(2.08 cm，2.20 cm)，二者的作用效果無顯著差異；50 mg·L-15-ALA對芽長的作用效果不顯著；當(dāng)濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)芽的生長被顯著(P<0.05)抑制，其長度為0.90 cm(圖3)。

圖3 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗芽長的影響Fig.3 Effects of 5-ALA on bud length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

由圖4可知，無脅迫存在時(shí)添加5 mg·L-15-ALA后的根長(1.71 cm)與對照(1.65 cm)相比促進(jìn)作用不顯著；當(dāng)濃度增加到25 mg·L-1時(shí)，5-ALA顯著促(P<0.05)進(jìn)了根的生長，根長為1.91 cm；隨著濃度的繼續(xù)增加，50，100 mg·L-1時(shí)對根的生長起到顯著的抑制作用(0.34 cm，0.29 cm)。在2 mg·L-1Cd脅迫下，不施加五氨基乙酰丙酸時(shí)早熟禾的根生長被顯著抑制，施加5，25 mg·L-15-ALA時(shí)，這種抑制作用被顯著緩解，根的長度分別比對照增加(0.73 cm，0.67 cm)，而施加50，100 mg·L-1的5-ALA時(shí)，不但對根的生長沒有緩解作用，反而抑制了根的伸長。

在100 mmol·L-1的NaCl脅迫下，施加5，25，50 mg·L-1的5-ALA與組內(nèi)對照相比均未能顯著促進(jìn)根的生長，其中濃度為5，25 mg·L-1時(shí)，雖有提高根的伸長效應(yīng)，但效果不顯著，濃度為50 mg·L-1抑制作用亦不顯著；當(dāng)濃度增加到100 mg·L-1時(shí)對根長(0.17 cm)的抑制作用變得顯著。在15%PEG脅迫下，0，5，25，50，100 mg·L-1的5-ALA每一組之間對根長的影響均存在顯著(P<0.05)差異；其中未添加5-ALA組平均根長比無脅迫存在下未添加5-ALA組平均根長增加0.82 cm，添加5 mg·L-1的5-ALA后，根長達(dá)到2.84 cm，顯著高于組內(nèi)對照；當(dāng)5-ALA濃度為25，50，100 mg·L-1時(shí)根長的徒增效應(yīng)被顯著抑制。

圖4 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗根長的影響Fig.4 Effects of 5-ALA on root length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

2.3 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗根、芽促進(jìn)率的影響

通過分析根促進(jìn)率及芽促進(jìn)率，可以更進(jìn)一步了解5-ALA對不同脅迫下幼苗生長的緩解作用。從圖5可以看出，在無脅迫及Cd和NaCl的脅迫下，5，25 mg·L-1的5-ALA對根的生長均有促進(jìn)作用，而50，100 mg·L-1的5-ALA對根的生長具有抑制作用；其中在無脅迫存在時(shí)5，25 mg·L-1的5-ALA對根的促進(jìn)率分別為6%，15%，50，100 mg·L-1的5-ALA對根的抑制率分別為80%和83%，二者之間差異不顯著。當(dāng)存在Cd脅迫時(shí)，添加較低濃度的5-ALA能顯著降低脅迫對根的抑制作用，當(dāng)濃度升到50，100 mg·L-1時(shí)，這種抑制作用不能得到改善。在NaCl脅迫下5，25 mg·L-1的5-ALA對根的促進(jìn)作用不存在顯著差異，而100 mg·L-1時(shí)的抑制作用顯著(P<0.05)強(qiáng)于50 mg·L-1。PEG脅迫下，只有5 mg·L-1的5-ALA對根的生長有促進(jìn)作用，且顯著高于其他濃度。

圖5 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗的根促進(jìn)率的影響 Fig.5 Effects of 5-ALA on inhibition rate of root length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

而對比芽促進(jìn)率(圖6)可知，無論在哪種脅迫下,4個(gè)濃度的5-ALA對芽促進(jìn)率的趨勢是一致的，其中25 mg·L-1時(shí)的促進(jìn)作用最強(qiáng)。當(dāng)無脅迫時(shí)濃度為50，100 mg·L-1的5-ALA對芽起抑制作用；當(dāng)存在Cd及PEG脅迫時(shí)，只有100 mg·L-1的5-ALA對芽的生長起顯著(P<0.05)，而其他3種濃度的5-ALA均能在一定程度上緩解脅迫的抑制作用；而對于NaCl脅迫下的芽生長情況來說，4中濃度的5-ALA均能有效緩解干旱脅迫對芽生長的抑制作用。

圖6 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗芽促進(jìn)率的影響 Fig.6 Effects of 5-ALA on inhibition rate of bud length of Poa pratensis Poa seedling under different stress treatments

2.4 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗可溶性蛋白的影響

可溶性蛋白含量在不同脅迫下呈現(xiàn)的趨勢不一致，無脅迫時(shí)添加25 mg·L-15-ALA后,可溶性蛋白的含量顯著降低(P<0.05)，與對照相比下降了5.6 μg·g-1，而添加其他濃度的5-ALA對可溶性蛋白含量沒有顯著影響。在Cd脅迫下，添加4種濃度的5-ALA后,可溶性蛋白含量均比對照升高，5-ALA濃度為100 mg·L-1時(shí)可溶性蛋白含量為487 μg·g-1，顯著高于對照(P<0.05)。NaCl脅迫下可溶蛋白含量的變化趨勢也呈現(xiàn)出均比對照高，添加5，25和100 mg·L-1的5-ALA后含量顯著高于對照(P<0.05)。而PEG脅迫下可溶性蛋白含量呈先降再升再降的趨勢，添加25 mg·L-1的5-ALA后可溶性蛋白含量顯著上升，添加100 mg·L-1的 5-ALA后可溶性蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

表1 不同脅迫處理下5-ALA對草地早熟禾幼苗可溶性蛋白含量的影響/μg·g-1Table 1 Effects of 5-ALA on soluble protein of Poa pretensis seedling under different stress treatments

3 討論

五氨基乙酰丙酸(5-ALA)很早就受到研究者的重視[14]。他具有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的功能，被視為一種新的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，5-ALA在高濃度下作為無污染的天然除草劑，在低濃度下可明顯增強(qiáng)多種植物的抗逆性[15]。所以5-ALA在當(dāng)今生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重惡化背景下，對提高作物生產(chǎn)水平具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)研究了金屬脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫及無脅迫條件下，添加外源5-ALA對草地早熟禾幼苗產(chǎn)生的影響。

3.1 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾萌發(fā)的影響

外源添加較低濃度(5，25 mg·L-1)的5-ALA當(dāng)無脅迫條件存在時(shí)，能提高幼苗的發(fā)芽勢及發(fā)芽率，但效應(yīng)不顯著；當(dāng)施加5-ALA的濃度逐漸升高(50，100 mg·L-1)時(shí)，顯著抑制了種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)，同時(shí)表現(xiàn)出發(fā)芽勢弱于發(fā)芽率，導(dǎo)致發(fā)芽不整齊，幼苗苗弱的較多。而當(dāng)重金屬、鹽及干旱脅迫存在時(shí)，隨著5-ALA濃度從低到高發(fā)芽勢及發(fā)芽率呈先增后降的趨勢，表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)高濃度抑制(或效應(yīng)不顯著)，其中5-ALA的濃度為25 mg·L-1時(shí)表現(xiàn)出的緩解作用最好(鹽脅迫下50 mg·L-1時(shí)表現(xiàn)的促進(jìn)作用最優(yōu))，試驗(yàn)結(jié)果與李小玲等[16]研究外源ALA對鹽脅迫下商洛黃芩生理特性的影響時(shí)得出的一定濃度5-ALA能提高植物抗逆性結(jié)果一致，同時(shí)印證了劉暉等[17]提出的5-ALA濃度不宜過高的結(jié)論。

3.2 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著5-ALA濃度的增加，幼苗的根長、芽長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且5-ALA濃度越高對根及芽的抑制作用越強(qiáng)，其中25 mg·L-1的5-ALA表現(xiàn)出的促進(jìn)作用最好。羅家傳等[18]研究ALA在小麥上的生產(chǎn)應(yīng)用效果試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小麥株高隨5-ALA劑量增加呈先增后減趨勢，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

Cd不是植物生長必須的微量元素，其存在會對植物產(chǎn)生毒害[19-20]，試驗(yàn)中未添加5-ALA的對照組草地早熟禾的幼苗變矮、根系變短，導(dǎo)致幼苗的活力下降。添加了較低濃度的5-ALA后，Cd對早熟禾的毒害作用明顯得到緩解，俞建良等[21]表明低濃度ALA具有促進(jìn)作物應(yīng)對各種惡劣生長條件(如鹽堿、低溫、弱光照和干旱等)的作用，但并未提到對重金屬脅迫下植物的保護(hù)作用，本試驗(yàn)進(jìn)一步證明了5-ALA提高植物應(yīng)對各種逆境的能力，且與5-ALA的濃度緊密相關(guān)。

5-ALA對于鹽脅迫及干旱脅迫植物的保護(hù)作用的相關(guān)研究較多，劉暉等人[18]發(fā)現(xiàn)，125 mmol·L-1NaCl處理下添加15～30 mg·L-1ALA可以明顯緩解鹽脅迫對西瓜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制效應(yīng)；外源ALA可減輕鹽脅迫對菠菜生長的抑制作用[22]。張春平等[23]研究外源5-ALA對干旱脅迫下甘草種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過5，10，15，30 mg·L-1的5-ALA處理后幼苗的胚根、胚芽均比對照長，但較高濃度(30 mg·L-1)處理效果不如低濃度，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同；另外張春平等[23]劉長利[24]等的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下胚芽生長受到的抑制作用程度大于胚根，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3 不同濃度5-ALA對逆境脅迫下草地早熟禾幼苗可溶性蛋白含量的影響

脅迫條件下植物積累蛋白是一種適應(yīng)機(jī)制，這些蛋白不僅與調(diào)控膜的透水性有關(guān)[25]，在一定程度上還代表著植物體光合性能[26]。本試驗(yàn)中，Cd及NaCl處理下添加5-ALA均能導(dǎo)致早熟禾幼苗中可溶性蛋白含量顯著升高，其中Cd脅迫下只有100 mg·L-1的5-ALA處理下可溶性蛋白含量顯著(P<0.05)高于對照。在PEG模擬的干旱脅迫下，25，50 mg·L-1的5-ALA可提高幼苗的可溶性蛋白，且25 mg·L-1時(shí)提高效果顯著(P<0.05)，但100 mg·L-1時(shí)可溶性蛋白含量顯著低于對照(P<0.05)。這表明合理濃度的外源5-ALA可促進(jìn)脅迫下早熟禾植株蛋白合成，維持植株的水分運(yùn)輸和葉片光合功能，從而促進(jìn)植株生長并提高抗逆性。

4 結(jié)論

不同脅迫(2 mg·L-1Cd，100 mmol·L-1NaCl，15%PEG)下，外源施加相對低濃度(5，25 mg·L-1)5-ALA均能起到緩解脅迫傷害效應(yīng)，而濃度逐漸升高后(50，100 mg·L-1)則起到抑制作用。具體表現(xiàn)為促進(jìn)早熟禾種子萌發(fā)、幼苗生長和可溶性蛋白積累，其中對種子萌發(fā)及幼苗的生長作用顯著，對可溶性蛋白含量的影響在不同脅迫下表現(xiàn)不盡相同。

綜合比較4種不同濃度5-ALA對草地早熟禾萌發(fā)的作用后發(fā)現(xiàn)，3種脅迫處理下，以25 mg·L-1的5-ALA抗脅迫效果最優(yōu)。