梁巧蘭， 魏列新， 張 娜， 徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730070)

白三葉草(Trifoliumrepens) 是一種多年生草本植物，是世界上最重要的牧草之一[1]。近年來(lái)三葉草在綠肥作物以及園林設(shè)計(jì)中的應(yīng)用較多，種植面積不斷擴(kuò)大。但是葉斑病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為限制三葉草栽培的主要病害之一。發(fā)病時(shí)葉片上產(chǎn)生褐色邊緣的白色小圓斑或不規(guī)則型病斑，葉片正、反面可見黑色分生孢子，以背面居多，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)葉片干枯死亡，嚴(yán)重影響白三葉草的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)失去觀賞價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于白三葉草葉斑病的研究較少，僅李晶[2]、羅祿怡[3]、商鴻生[4,5]、周曉燕[6]、李征[7]等人進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道。長(zhǎng)期以來(lái)生產(chǎn)上主要采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，而化學(xué)藥劑防治存在農(nóng)藥殘留、污染等問題，使其觀賞價(jià)值降低，同時(shí)影響人類健康。而誘導(dǎo)抗病性是指植物在各種誘導(dǎo)因子的作用下，使植物體內(nèi)與抗病有關(guān)的基因得到表達(dá)，從而產(chǎn)生抗病性，即系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)[8-10]。目前，植物誘導(dǎo)抗病性為植物病害的防治開辟了一條新途徑。利用化學(xué)誘抗劑水楊酸、納米硅、草酸鉀、草酸銨誘導(dǎo)植物抗病性已有報(bào)道[11-14]。但是，有關(guān)蘭州市白三葉草葉斑病病原鑒定及利用誘導(dǎo)抗病性防治白三葉草葉斑病的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)對(duì)引起蘭州市白三葉草葉斑病的病原菌進(jìn)行了鑒定，并選用水楊酸、硅酸鉀、硅酸鈉3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草葉斑病誘導(dǎo)抗性進(jìn)行了研究，旨在確定這3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草葉斑病抗病性的誘導(dǎo)效果，為白三葉草生長(zhǎng)期病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

白三葉草葉斑病病樣采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園、北濱河路、植物園、五泉山等地三葉草綠化帶；供試白三葉草種植于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)(品種為普通白三葉)。

供試化學(xué)物質(zhì) 水楊酸(SA)、硅酸鈉(Na2SiO3)、硅酸鉀(K2SiO3)購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌分離純化及鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離純化 將采集的病樣清洗干凈后，于超凈工作臺(tái)上切取葉片病健交界組織，經(jīng)0.1%升汞表面消毒10 S，用滅菌水沖洗3～5次后，接種于PDA平板上，置于28℃溫箱中培養(yǎng)觀察，當(dāng)邊緣長(zhǎng)出菌絲時(shí)，挑去少量菌絲重新接在新制PDA平板上，直至每一皿的菌落形態(tài)一致并產(chǎn)孢后，采用單孢分離法[15]對(duì)分離菌進(jìn)行純化。

1.2.1.2 分離菌致病性測(cè)定 按照柯赫氏法則進(jìn)行。將分離物配制成孢子懸浮液接種到白三葉草葉片上，在28℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況。待發(fā)病后再次分離，并將分離物與1.2.1.1.中分離純化得到的進(jìn)行比較，然后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 病原菌的鑒定 顯微鏡下觀察病原菌菌絲及孢子形態(tài)，并結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行鑒定。

1.2.23種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草葉斑病病原菌抑菌作用及其誘導(dǎo)抗病效果 采用“生長(zhǎng)速率法”，將水楊酸、硅酸鈉、硅酸鉀用滅菌水分別配制成100 μg·mL-1×50倍、50 μg·mL-1×50倍、25 μg·mL-1×50倍，在無(wú)菌條件下取1 mL不同濃度的溶液加入49 mL PDA培養(yǎng)基中搖勻后倒入4個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中，以加無(wú)菌水為對(duì)照，做好標(biāo)記。在無(wú)菌操作條件下將經(jīng)過PDA活化培養(yǎng)3 d的白三葉草葉斑病菌用滅過菌的打孔器沿菌落邊緣制成菌餅，并將菌餅接種于冷卻后的含藥PDA上，在28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法測(cè)定菌落的直徑，并按下式計(jì)算不同化學(xué)物質(zhì)的抑菌率。

將健康的三葉草葉片經(jīng)75%酒精消毒、滅菌水沖洗干凈，用篩選出的無(wú)抑菌活性的化學(xué)物質(zhì)(上述不同濃度)處理葉片后，葉面朝上放置于已滅菌并有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，2 d后噴霧接種葉斑病病原菌的孢子懸浮液(1.0×l04個(gè)·mL-1)，用清水作對(duì)照，然后室溫保濕培養(yǎng)，接種7 d后按下列分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病數(shù)，并按下式計(jì)算病情指數(shù)和誘導(dǎo)抗病效果。

白三葉草葉斑病癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[15]：0級(jí) 無(wú)癥狀；1級(jí)：病斑占葉面積1/16；2級(jí)：病斑病斑占葉面積1/8～1/4； 3級(jí)：病斑占葉面積5/16～1/2；4級(jí)：病斑占葉面積9/16～3/4。

1.2.33種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草酶活性的影響

1.2.3.1 試驗(yàn)方法 用篩選出的具有誘導(dǎo)抗病效果的一定濃度的水楊酸、硅酸鉀和硅酸鈉以葉面噴霧的方式處理白三葉草植株，處理2 d后采用噴霧法接種葉斑病病原菌孢子懸浮液(1.0×104個(gè)·mL-1)，分別設(shè)置清水處理(CK)、接菌(Al)、水楊酸(SA)、硅酸鈉(Na2SiO3)、硅酸鉀(K2SiO3)、水楊酸+接菌(SA+Al)、硅酸鈉+接菌(Na2SiO3+Al)、硅酸鉀+接菌(K2SiO3+Al)幾個(gè)不同處理，并于處理后1，3，5，7 d及接種前1 d，采集處理的白三葉草葉片，利用生物化學(xué)方法測(cè)定多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)，所有測(cè)定重復(fù)3次。

1.2.3.2 酶液的提取、活性的測(cè)定及計(jì)算 分別參考El Ghaouth[16]和中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所[17]的方法對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)進(jìn)行提取及酶活性測(cè)定；POD、PPO的提取采用袁慶華等[20]方法。POD的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚作底物，用分光度法測(cè)定生成物的含量，在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以1 mL去離子水代替H2O2為對(duì)照[17]。

在上述反應(yīng)條件下，以每分鐘每克鮮樣A值變化1.00所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。各樣品均測(cè)定2次，3個(gè)重復(fù)。以上數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進(jìn)行LSD法統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05。

1.2.43種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草田間誘導(dǎo)防病效果測(cè)定 將3種化學(xué)物質(zhì)配成濃度為25 μg·mL-1的溶液，噴霧處理田間三葉草植株，以不同化學(xué)物質(zhì)作為處理，每個(gè)處理樣方0.25 m2(約300株)，重復(fù)3次，以清水噴霧為對(duì)照。分別于處理前和處理后7、14 d按1.2.2中分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用5點(diǎn)取樣法，每樣點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查30株，共90個(gè)葉片，并按下式計(jì)算田間發(fā)病率、病情指數(shù)(同1.2.2)及誘導(dǎo)防治效果(參考農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則，略有修改)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉草葉斑病田間癥狀

白三葉草葉斑病產(chǎn)生兩種類型的病斑，一種為邊緣呈褐色或淡綠色的白色小圓斑或不規(guī)則型病斑，另一種為白色病斑，無(wú)褐色邊緣；在秋天病葉正、反面可見黑色分生孢子，以背面居多，莖上產(chǎn)生褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)莖和葉片干枯死亡(圖1)。

圖1 白三葉草葉斑病癥狀(A，B：邊緣為褐色的白色病斑；C：白三葉草葉片背面的的病斑；D：白色病斑；E：莖上的褐色病斑及黑色分生孢子；F：對(duì)照)
Fig.1 Symptoms of white clover leaf spot disease(A,B,C：white disease spot with brown leaf edge on both the obverse and inverse sides; D: white disease spot on leaf；E: brown disease spot and black conidia on the stems；F: control

2.2 白三葉草葉斑病病原菌鑒定

通過致病性測(cè)定和培養(yǎng)形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)分離純化的菌株接種白三葉草葉片 5 d后出現(xiàn)褐色病斑，其癥狀與采集的樣品癥狀一致，并且從病斑上分離得到的分離物與起初分離到的一致，表明該分離物為白三葉草葉斑病的病原菌；在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初期菌落為乳白色、圓形、其上有同心輪紋，后期菌落逐漸轉(zhuǎn)為灰褐色至黑色，同心輪紋漸漸消失。分生孢子梗褐色，分枝或不分枝，有隔。分生孢子暗褐色，卵形至倒棍棒形，具0～6個(gè)縱隔膜，1～9個(gè)橫隔膜，基部圓滑。菌絲無(wú)色透明，有分隔。根據(jù)病原菌形態(tài)特征結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)將其鑒定為鏈孢霉目(Moniliales)、黑霉科(Dematiaceae)豆鏈格孢菌(Alternariaazukiae)(圖2)。

圖2 白三葉草葉斑病病原菌(A、B:分別為單孢分離菌前、后期培養(yǎng)形態(tài)；C:菌絲及分生孢子)
Fig.2 Pathogen of white clover leaf spot disease(A,B：Colony morphology of single spore isolates at early and final culture; C: Hyphae and spores

2.3 3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)豆鏈格孢菌抑菌率活性測(cè)定及其誘導(dǎo)抗病效果

通過對(duì)不同濃度3種化學(xué)物質(zhì)抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明水楊酸、硅酸鈉和硅酸鉀對(duì)白三葉草葉斑病菌的抑制作用較低，濃度為100 μg·mL-1時(shí)3種化學(xué)物質(zhì)的抑菌率最高，分別為7.55%，4.44%和8.29%，隨著濃度的降低，抑菌率逐漸降低，當(dāng)濃度為25 μg·mL-1時(shí)，硅酸鈉的抑菌率僅為0.59%(表1)。

誘導(dǎo)抗病性試驗(yàn)結(jié)果表明：不同處理的白三葉草葉斑病發(fā)生情況不同。經(jīng)方差分析表明，同一化學(xué)物質(zhì)不同濃度處理的病情指數(shù)與對(duì)照的病情指數(shù)之間均存在顯著差異，而且3個(gè)濃度處理的病情指數(shù)之間也存在顯著差異，其中濃度為25 μg·mL-1時(shí)3種化學(xué)物質(zhì)處理的病情指數(shù)均低于其他兩個(gè)濃度處理的。同一濃度不同化學(xué)物質(zhì)處理的病情指數(shù)與對(duì)照的病情指數(shù)之間均存在顯著差異，濃度為100 μg·mL-1時(shí)，水楊酸與硅酸鈉處理的病情指數(shù)之間存在顯著差異，而硅酸鉀處理的病情指數(shù)介于二者之間；濃度為50 μg·mL-1時(shí)，水楊酸與硅酸鈉、硅酸鉀處理的病情指數(shù)之間存在顯著差異，而硅酸鈉、硅酸鉀處理的病情指數(shù)之間差異不顯著；濃度為25 μg·mL-1時(shí)，水楊酸、硅酸鉀處理的病情指數(shù)與硅酸鈉處理的病情指數(shù)之間存在顯著差異，而水楊酸、硅酸鉀2種化學(xué)物質(zhì)處理的病情指數(shù)之間差異不顯著。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：所選用的3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草葉片抗豆鏈格孢菌均有一定誘導(dǎo)作用，在3種濃度下的誘導(dǎo)抗病效果均在45%以上，且低濃度時(shí)誘導(dǎo)抗病效果均略高于高濃度處理，當(dāng)濃度為25 μg·mL-1時(shí)，3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)抗病效果均最好，分別為53.18%，53.73%和45.69%(表1)。

表1 3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草葉斑病菌的誘導(dǎo)抗病效果Table 1 Induced resistant effect of three kinds of chemical to Alternaria azukiae

注：不同大寫字母表示同一物質(zhì)不同濃度處理之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一濃度不同物質(zhì)處理之間差異顯著(P<0.05)

Note: Different capital letter indicate significant differences among the same substance at different concentration treatments and control at the 0.05 level；different lowercase letters indicate significant differences among the same concentrations of different substance treatments at the 0.05 level

2.4 3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理對(duì)白三葉草酶活性的影響

2.4.13種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理對(duì)白三葉草葉片多酚氧化酶(PPO)活性的影響 3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理對(duì)白三葉草葉片中多酚氧化酶(PPO)活性均有影響，PPO活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中硅酸鉀(K2SiO3+Al)和硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導(dǎo)處理的葉片中PPO活性在第3 d均達(dá)到峰值，水楊酸誘導(dǎo)處理在第5 d達(dá)到峰值，分別為0.24，0.05，0.11 U·mg-1·min-1，且25 μg·mL-1硅酸鉀誘導(dǎo)(K2SiO3+Al)處理后，在第1，3，5，7 d時(shí)PPO活性均高于對(duì)照(CK)及其他處理，且與其他處理的酶活性之間存在極顯著差異，尤其在第3，5 d時(shí)硅酸鉀誘導(dǎo)處理(K2SiO3+Al)的PPO活性分別比對(duì)照(CK)的提高了92.98%和92.53%，比接菌(Al)處理提高了76.03%和73.63%，比硅酸鈉、水楊酸誘導(dǎo)處理的分別提高了79.34%和82.09%、75.61%和46.26%，(圖3)；水楊酸誘導(dǎo)處理(SA+Al)在第5，7 d時(shí)PPO活性高于對(duì)照(CK)、接菌(Al)、硅酸鈉+接菌(Na2SiO3+Al)處理，分別比對(duì)照(CK)提高了86.11%和82.41%、比接菌(Al)提高了50.93%和41.67%、比硅酸鈉+接菌(Na2SiO3+Al)處理提高了66.67%和66.67%，但略低于水楊酸(SA)處理；且酶活性之間存在極顯著差異；硅酸鈉誘導(dǎo)處理(Na2SiO3+Al)的酶活性均低于硅酸鉀誘導(dǎo)處理(K2SiO3+Al)和水楊酸誘導(dǎo)處理(SA+Al)(圖3)。

圖3 3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理對(duì)三葉草葉片中PPO活性影響
Fig.3 Effect of induction treatment of three chemical substances on PPO activities of white clover leaves
注：不同小寫字母表示同一天不同物質(zhì)處理的酶活性之間差異顯著性(P<0.05)，下同
Note: Different lowercase letters showed significant differences at the same day of different substance treatments at the 0.05 level，the same as below

2.4.23種化學(xué)物質(zhì)對(duì)過氧化物酶(POD)活性的影響 3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理對(duì)白三葉草葉片中過氧化物酶(POD)的活性均有影響，POD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在第5 d時(shí)POD活性均達(dá)到峰值，分別為9.70，7.92，8.51 U·mg-1·min-1；第1 d時(shí)除水楊酸誘導(dǎo)處理的POD活性高于SA、CK和接菌處理外，硅酸鉀(K2SiO3+Al)、硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導(dǎo)處理的POD活性低于硅酸鉀(K2SiO3)、硅酸鈉(Na2SiO3)的處理，高于對(duì)照(CK)和接菌(Al)處理；硅酸鉀(K2SiO3+Al)誘導(dǎo)處理的分別比對(duì)照(CK)、接菌(Al)、硅酸鉀(K2SiO3)處理的POD活性高6.65，6.40，0.95 U·mg-1·min-1，水楊酸(SA+Al)誘導(dǎo)處理的POD活性分別比對(duì)照(CK)、接菌(Al)、水楊酸(SA)處理的高5.75，5.50，1.76 U·mg-1·min-1，硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導(dǎo)處理的POD活性分別比對(duì)照(CK)、接菌(Al)和硅酸鈉(Na2SiO3)處理高3.85，3.60和0.26 U·mg-1·min-1，且硅酸鉀誘導(dǎo)處理(K2SiO3+Al)的POD活性和水楊酸(SA+Al)、硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導(dǎo)處理的酶活性之間均存在極顯著差異(圖4)。

圖4 3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理對(duì)三葉草葉片中POD活性影響
Fig.4 Effect of induction treatment of three chemical substances on POD activities of white clover leaves

2.4.33種化學(xué)物質(zhì)對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響 硅酸鉀(K2SiO3+Al)、硅酸鈉(Na2SiO3+Al)和水楊酸(SA+Al)誘導(dǎo)處理對(duì)白三葉草葉片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性均有影響，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在第5 d時(shí)PAL活性均達(dá)到峰值，分別為9.63，7.78，8.12 U·mg-1·min-1；其中硅酸鉀(K2SiO3+Al)誘導(dǎo)處理后PAL活性分別比水楊酸(SA+Al)和硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導(dǎo)處理高了0.36%，14.69%，15.68%，10.64%和28.74%，19.93%，19.22%，22.38%，比對(duì)照(CK)提高了28.41%，25.00%，36.04%， 35.33%，與其他處理的PAL酶活性之間存在極顯著差異(圖5)。

圖5 3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理對(duì)三葉草葉片中PAL活性影響
Fig.5 Effect of induction treatment of three chemical substances on PAL activities of white clover leaves

2.5 3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草田間誘導(dǎo)防病效果測(cè)定

田間誘導(dǎo)防病效果測(cè)定結(jié)果表明3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草抗葉斑病均有一定的誘導(dǎo)防治作用，處理后7 d的誘導(dǎo)防病效果均達(dá)到72%以上，其中硅酸鉀的誘導(dǎo)防治效果最好為81.22%，水楊酸次之，硅酸鈉最低；誘導(dǎo)處理14 d后硅酸鉀、硅酸鈉和水楊酸的誘導(dǎo)防病效果分別比處理后7 d的降低了64.06%，67.96%和61.35%(表2)。

表2 3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草抗葉斑病田間誘導(dǎo)防治效果Table 2 Inducted resistant effect of three kinds of chemical substances on white clover against leaf spot in the field

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

誘導(dǎo)抗病性是利用物理、化學(xué)及生物的方法預(yù)先處理植株，改變植物對(duì)病害的反應(yīng)，使原來(lái)感病反應(yīng)產(chǎn)生局部或系統(tǒng)的抗性。水楊酸(salicylic acid， SA)是一種簡(jiǎn)單的酚類化合物，最先在柳樹皮的提取物中被發(fā)現(xiàn)，作為一種重要的植物防衛(wèi)激素，在植物防御反應(yīng)尤其是SAR中起著重要的作用[19]，外源SA 處理可以誘導(dǎo)水稻 (OryzasativaL.)、芒果(MangiferaindicaL.)、花生(ArachishypogaeaLinn.)、香蕉(Musaparadisiaca)、桉樹(Eucalyptus)、棉花(AnemonevitifoliaBuch)、玉米(ZeamaysL.)、辣椒(CapsicumannuumL.,)、草坪型高羊茅(Festucaarundinacea)、觀賞百合(LiliumL.)等多種植物病害產(chǎn)生局部和系統(tǒng)抗性[13-14,20-21]；另外適宜濃度的外源SA可以提高苜蓿的抗旱性及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性[22]以及初花期扁蓿豆光合作用，提高其干物質(zhì)產(chǎn)量和飼草品質(zhì)[23]；硅酸鈉作為誘抗劑在水稻抗稻瘟病、蘋果梨、厚皮甜瓜、杏等采后病害方面有報(bào)道；而硅酸鉀作為誘抗劑的研究尚未見報(bào)道。植物誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生通常是通過酶催化調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)，植物受到病原菌侵染或被誘導(dǎo)處理后，與抗病反應(yīng)密切相關(guān)的防御酶活性升高是誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的重要機(jī)制之一[8]；本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：SA 、硅酸鉀、硅酸鈉誘導(dǎo)后能引起白三葉草葉片內(nèi)POD，PPO 和PAL 活性的升高，這與高峰[24]、李云華[25]、葛永紅[25]等報(bào)道的在辣椒、花生、棉花、水稻、煙草、玉米等植物上施用SA，蘋果梨、杏采后硅酸鈉處理對(duì)防御酶影響的結(jié)果相似。POD是植物體內(nèi)普遍存在的氧化還原酶，他不僅參與了木質(zhì)素、酚類物質(zhì)及植保素的合成，還作為整個(gè)代謝途徑的調(diào)節(jié)因子，通過影響植物體內(nèi)多種代謝途徑而在抗病性中起作用，是與植物抗病有關(guān)的一種重要酶[27-28]。多酚氧化酶(PPO)是酚類物質(zhì)氧化的關(guān)鍵酶，參與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生醌類并參與木質(zhì)素的合成，催化酚類物質(zhì)氧化形成的預(yù)苯酸是合成木質(zhì)素的前提，可以修復(fù)傷口，殺死和抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用[29]。PAL活性與植物抗病性密切相關(guān)，其活性可作為衡量植物抗病性的生化指標(biāo)之一。植物感染病原菌后PAL活性明顯升高，并表現(xiàn)出規(guī)律性的變化，如張淑珍[30]等在對(duì)疫霉根腐病菌毒素脅迫下不同大豆抗感品種PAL活性的研究中發(fā)現(xiàn)，抗病大豆品種的根、莖和葉中PAL活性在病程的大部分階段都高于對(duì)照，PAL的植物抗病機(jī)制主要表現(xiàn)為參與植保素、木質(zhì)素和酚類物質(zhì)的合成[31]。由此可見這3種酶活性的提高是植物抗病性增強(qiáng)的具體表現(xiàn)。本試驗(yàn)結(jié)果也表明經(jīng)水楊酸、硅酸鉀、硅酸鈉誘導(dǎo)處理后，白三葉草葉片組織內(nèi)病程相關(guān)蛋白酶PPO、POD和PAL活性均在短時(shí)間內(nèi)提高，表現(xiàn)出規(guī)律性變化，且明顯高于對(duì)照，表明這三種化學(xué)物質(zhì)能夠激活白三葉草葉片的防御體系，使白三葉草葉片產(chǎn)生了對(duì)葉斑病的抗性；3種化學(xué)物質(zhì)處理后PPO變化規(guī)律不同，硅酸鉀、硅酸鈉處理可使白三葉草葉片中的PPO在短時(shí)間內(nèi)活性迅速升高，在第3 d達(dá)到峰值，水楊酸處理后PPO活性在第5 d達(dá)到峰值，而POD、PAL變化一致，可在第5天達(dá)到峰值，這表明3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草抗葉斑病的誘導(dǎo)機(jī)制可能存在差異，本試驗(yàn)尚未涉及；另外，田間試驗(yàn)結(jié)果表明3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草抗葉斑病有一定的誘導(dǎo)防治效果，但隨著時(shí)間推移誘導(dǎo)防病效果明顯降低，對(duì)于這3種化學(xué)物質(zhì)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)抗病性持效期以及能否誘導(dǎo)白三葉草葉片產(chǎn)生對(duì)其他葉部病害的抗性等問題還有待于進(jìn)一步研究。

3.2 結(jié)論

經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)豆鏈格孢菌(Alternariaazukiae)為引起蘭州地區(qū)白三葉草葉斑病的病原菌；濃度為25 μg·mL-1的硅酸鉀、硅酸鈉、水楊酸對(duì)豆鏈格孢菌抑菌率較低且室內(nèi)誘導(dǎo)抗病效果最好，分別為53.18%，53.73%和 48.69%；經(jīng)3種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)處理后，白三葉組織內(nèi)與病程相關(guān)的抗氧化酶POD和PPO活性均在短時(shí)間內(nèi)提高，且明顯高于對(duì)照。3種化學(xué)物質(zhì)田間處理對(duì)白三葉草抗葉斑病均有一定的誘導(dǎo)效果，處理后7 d的誘導(dǎo)防病效果均達(dá)到72%以上，其中硅酸鉀的誘導(dǎo)抗病效果最好，為81.22%；誘導(dǎo)處理14 d后硅酸鉀、硅酸鈉和水楊酸的誘導(dǎo)防病效果分別比處理后7 d的降低了64.06%，67.96%和61.35%，表明3種化學(xué)物質(zhì)對(duì)白三葉草抗葉斑病均有較好的誘導(dǎo)防病作用。