劉 莉， 李培英

(新疆農業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院 新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830052)

狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)，又名拌根草、鐵線草、爬地草、百慕大草(Bermudagrass)，系禾本科狗牙根屬C4型多年生草本植物[1]。狗牙根亦是我國分布廣泛、栽培應用較多、最重要的暖季型草坪草之一[2-4]。目前，國產狗牙根品種匱乏，國內栽培的狗牙根主要依賴進口，存在品種較單一、抗逆性差、容易退化等問題，極大地限制了狗牙根在草坪中的應用，因此國家提倡開發(fā)本土狗牙根資源，選育優(yōu)質、高抗的狗牙根新品種，滿足市場需求[5]。

狗牙根育種主要手段包括常規(guī)育種及生物技術育種兩種方式，生物技術育種的瓶頸在于狗牙根胚性愈傷組織得率較低、且難以分化。狗牙根組培研究開展較早，上世紀80年代Ahn以普通狗牙根未成熟花序為外植體誘導出了胚性愈傷組織，并獲得了再生植株[6]。此后狗牙根組培多以未成熟胚及花序為外植體開展研究，但其取材困難且易受季節(jié)限制[7-9]。近些年來，以匍匐莖為外植體的組織培養(yǎng)也獲得了再生植株，其中，盧少云以匍匐莖為外植體建立了再生體系，并在再生植株中發(fā)現(xiàn)了狗牙根‘Tifeagle’的矮化變異體新株系TV4。匍匐莖取材簡單，但仍存在消毒困難，易受污染的問題[10]。相對而言，成熟穎果取材方便、消毒簡單，是組織培養(yǎng)建立再生體系較好的材料。國內方面，胡張華在2003年首次以成熟胚為外植體進行組織培養(yǎng)并獲得再生植株[11]，此后何陽鵬、姜茜、陳瓊等都以成熟種子為材料進行了狗牙根組培研究[12-14]。但已有研究大多采用單因素試驗方法，可能得不到最優(yōu)組合，并且不能確定出各個階段起關鍵作用的因素[15-16]。

正交試驗設計是一種高效、快速、經濟的試驗方法[15,17]，不但可以進一步優(yōu)化培養(yǎng)基，還可以確定建立再生體系中各階段的主因素。在草坪草上，陳繼琴用正交試驗法對愈傷組織的誘導和分化培養(yǎng)基進行了優(yōu)化[18]；劉君通過多因子正交試驗篩選出草地早熟禾(PoapratensisL.)的最適誘導培養(yǎng)基，證明了用正交設計篩選愈傷誘導培養(yǎng)基是一種較好、可靠的方法[19]。因此，為了進一步優(yōu)化‘新農1號’狗牙根再生體系，本試驗在陳瓊[14]的單因素法建立的再生體系的基礎上，采用了正交設計方法，探討生長調節(jié)劑、外源添加物等因素對‘新農1號’狗牙根成熟種子愈傷誘導和分化的影響，為狗牙根生物技術育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中，試驗材料為2012采于新疆農業(yè)大學三坪農場的‘新農1號’狗牙根(Cynodondactylon‘Xinnong No.1’)成熟種子。

1.2 試驗方法

1.2.1種子表面消毒及愈傷組織誘導 挑選籽粒飽滿的‘新農1號’狗牙根種子，脫殼，在清水中浸泡24 h，70%酒精處理2 min后，置于20%次氯酸鈉中浸泡20 min，無菌水沖洗多次。將滅菌后的狗牙根種子進行橫切，挑選有胚部分，以添加0.8%瓊脂和3%蔗糖的MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，脯氨酸(Proline， Pro 或P)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine， 6-BA)按3因素3水平(L9)的正交設計進行添加(表1)。

表1 ‘新農1號’狗牙根誘導培養(yǎng)基試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of induction medium of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每種培養(yǎng)基30瓶，每瓶接入20個外植體， 25±1.0℃條件下進行黑暗培養(yǎng)，誘導25 d后，觀察愈傷組織狀態(tài)，統(tǒng)計誘導愈傷數，計算出愈率。

1.2.2愈傷組織的繼代培養(yǎng) 挑取淡黃色顆粒狀的愈傷組織切割成3 mm左右的愈傷團塊進行繼代培養(yǎng)，以添加0.8%瓊脂和3%蔗糖的MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，脫落酸(abscisic acid， ABA)、2,4-D、6-BA按3因素3水平(L9)的正交設計進行添加(表2)。

表2 ‘新農1號’狗牙根繼代培養(yǎng)基試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of subculture medium Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每個處理組合接種30瓶，每瓶6塊愈傷組織，溫度25±1.0℃、光照強度36 mmol·m-2·s- 1， 14 h光照與10 h黑暗培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計胚性愈傷數、胚性愈傷的增殖數(直徑大于5 mm的胚性愈傷組織塊數)、褐化數。計算胚性愈傷誘導率、愈傷增殖率以及褐化率。

1.2.3愈傷組織的分化培養(yǎng) 將胚性愈傷組織均勻地切割成3 mm左右團塊，轉至分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(表3)。

表3 ‘新農1號’狗牙根胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基Table 3 Embryogenic callus differentiation medium of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每個處理接種30瓶，每瓶6塊胚性愈傷。分化30 d后，統(tǒng)計綠點數、再生小植株數(以出現(xiàn)3個芽為一個再生苗)、再生愈傷組織塊數，計算綠點率、再生愈傷組織頻率、小植株形成強度(小植株形成強度=小植株數/接種的愈傷組織數)。

1.2.4再生苗的生根與移栽 將分化培養(yǎng)的再生苗轉移到添加8 g·L-1瓊脂和15 g·L-1蔗糖的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，2周后打開蓋子，洗去培養(yǎng)基，室內煉苗2 d，再移栽到含營養(yǎng)土的花盆中。

1.3 數據分析

試驗以正交設計作為分析方法，記錄3個重復的平均數作為結果，對結果的極差分析及單因素方差分析采用Excel、Spss等軟件進行。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導

接入外植體培養(yǎng)4 d后，一些白色透明、無固定結構、松軟的愈傷組織逐漸產生；10 d出現(xiàn)出愈高峰，12 d左右開始膨大，15 d愈傷長至3～5 mm，誘導25 d后，愈傷已長至5～11 mm。在愈傷誘導階段形成的愈傷主要有4種類型：A型為半透明水漬狀愈傷(圖1-A)；B型為半透明水漬狀、帶有少數淡黃色顆粒的愈傷(圖1-B)；C型為淡黃色顆粒較多的愈傷(圖1-C)；D型為白色疏松狀的愈傷(圖1-D)。其中C型為胚性愈傷，B型可經繼代改造為胚性愈傷，而A型和D型為不可再生的非胚性愈傷。不同培養(yǎng)基上誘導的愈傷大小和狀態(tài)主要受2,4-D濃度的影響。2,4-D濃度為1.0 mg·L-1水平時，愈傷生長速度較快，愈傷直徑可達8～11 mm，但愈傷質量較差，形成的愈傷組織少數為B型、大多為A型和D型；當2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時，愈傷生長速度適中，愈傷直徑可達4～8 mm，愈傷質量較好，主要為B型和C型，但也有一定數量的D型愈傷；當2,4-D濃度為4.0 mg·L-1時，愈傷生長較慢，直徑為3～5 mm，愈傷質量也較好，大多為B型和C型，也有一些A型愈傷。

圖1 ‘新農1號’狗牙根愈傷組織類型圖
Fig.1 Callus induction type of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’
注：圖1-A：半透明水漬狀愈傷組織；圖1-B：少數淡黃色顆粒的愈傷組織；圖1-C：淡黃色顆粒較多的愈傷組織；圖1-D：白色疏松狀愈傷組織
Note：Fig.1-A: translucent water-soaked callus; Fig. 1-B: a few light yellow particles callus;
Fig. 1-C: pale yellow particles more callus. Fig. 1-D: white loose callus

表4‘新農1號’狗牙根愈傷組織誘導正交試驗
Table 4 The orthogonal test result of callus induction ofCynodondactylon‘Xinnong No.1’

處理Treatment因素及水平Factors and levels/mg·L-1出愈率Callus induction rate/%2,4-D6-BA脯氨酸123愈傷狀態(tài)Callus type11.00.01061.561.559.5B,D21.00.0520054.053.556.0A,B,D31.00.1040057.559.058.0A,B,D42.00.0120069.570.568.0A,B,C52.00.0540064.562.565.5B,C,D62.00.10056.057.558.5B,C,D74.00.0140051.053.053.0B,C84.00.05053.556.054.0A,B,C94.00.1020053.552.554.0A,B,CX157.83bB60.84aA57.55bAX263.61aA57.72bB59.28aAX353.61cC56.50bB58.22abAR10.004.341.73

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；X1、X2、X3分別代表3個不同水平的出愈率均值，R代表3個水平間的出愈率極差,下同

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level, and different capital letters indicate significant differences at the 0.01 level;X1, X2 and X3 represent average callus induction rate of three different levels, and R represents the maximum difference between the 3 levels; The same below

由表4可知，對出愈率而言，不同2,4-D和6-BA濃度間均存在極顯著差異(P<0.01)，而不同脯氨酸濃度之間存在顯著差異(P<0.05)。2.0 mg·L-12,4-D水平下的出愈率為63.61%，極顯著高于1.0 mg·L-1與4.0 mg·L-1水平 ；0.01 mg·L-16-BA水平下的出愈率為60.84%，極顯著高于0.05與0.1 mg·L-1水平；200 mg·L-1脯氨酸水平下的出愈率為59.28%，顯著高于不添加脯氨酸。由極差分析可知，各因素對出愈率的作用效果不同，其中 2,4-D的影響最大，其次為6-BA，脯氨酸。水平優(yōu)選后即可得出‘新農1號’狗牙根適宜的誘導培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.01 mg·L-1)+脯氨酸(200 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

2.2 愈傷組織的繼代

轉入繼代培養(yǎng)基中2～5 d后，愈傷變得稀軟，形成E型愈傷(圖2-A)；大多愈傷之后逐漸干燥，一些形成緊實致密的F型可再生愈傷(圖2-B)，少數變成褐化的G型愈傷(圖2-C)，還有一部分出現(xiàn)生根現(xiàn)象的H型愈傷(圖2-D)，另外一些逐漸變得水漬化，需轉入新的繼代培養(yǎng)基。

圖2 ‘新農1號’狗牙根愈傷組織類型圖
Fig.2 Callus subculture type of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’
注：圖2-A：稀軟，粘稠狀的愈傷組織；圖2-B：呈淡黃色顆粒狀，質地緊密的愈傷組織； 圖2-C：褐化的愈傷組織； 圖2-D：愈傷呈顆粒狀，有生根現(xiàn)象
Note：Fig.2-A: Callus was soft, sticky；2-B: Callus was pale yellow particles, close texture；2-C: Callus browning；2-D: Callus granular, a root phenomenon.

由表5可知，對胚性愈傷得率而言，不同6-BA、ABA濃度之間存在極顯著差異(P<0.01)， 2,4-D濃度間存在顯著差異(P<0.05)。其中2,4-D，6-BA，ABA的最優(yōu)濃度分別為2.0，0.20和2.0 mg·L-1，其胚性愈傷誘導率分別為52.96%，55.56%和56.85%。由極差分析可知，各因素對胚性愈傷誘導率的作用效果不同，其中2,4-D的影響最大，其次為ABA，6-BA。水平優(yōu)選后可得在‘新農1號’狗牙根繼代試驗中，胚性愈傷得率較高的培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

對愈傷增殖率而言(表5)，不同6-BA濃度之間存在極顯著差異(P<0.01)，不同2,4-D、ABA濃度之間存在顯著差異(P<0.05)。2.0 mg·L-12,4-D水平下的愈傷增殖率達44.26%，顯著高于0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1水平；0.20 mg·L-16-BA水平下的愈傷增殖率達64.82%，極顯著高于0.05和0.10 mg·L-1；1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1ABA水平下的愈傷增殖率分別為47.03%和45.37%，都顯著高于3.0 mg·L-1水平，但這兩個水平間沒有顯著差異。由極差分析可知，各因素對愈傷增殖的作用效果不同，其中6-BA的影響效果最大，其次為ABA、2,4-D。水平優(yōu)選后，愈傷增殖率較高的培養(yǎng)基為：2,4-D (2.0 mg·L-1) +6-BA (0.20 mg·L-1) + ABA (1.0～2.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

對褐化率而言(表5)， 2,4-D、6-BA濃度間存在極顯著(P<0.01)差異，但ABA濃度間不存在顯著差異。2.0 mg·L-12,4-D的褐化率僅為9.82%，顯著低于0.5和1.0 mg·L-1水平；0.20 mg·L-16-BA水平下的褐化率為12.04%，極顯著低于0.10 mg·L-1；由極差分析可知，對褐化率而言，2,4-D的影響最大，其次為6-BA和ABA。水平優(yōu)選后即可得褐化率較低的培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+ 6-BA(0.20 mg·L-1)+ ABA(1.0～3.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基。

綜合分析繼代培養(yǎng)中胚性愈傷率、愈傷增殖率和褐化率3個指標，可確定‘新農1號’狗牙根繼代培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)。此條件下的胚性愈傷率達71.67%，愈傷增殖率為61.67%，褐化率5.56%。

2.3 愈傷組織的分化

繼代改造后的胚性愈傷組織可轉移到不同的分化培養(yǎng)基上進行愈傷的再生培養(yǎng)。愈傷分化過程中，4種處理的綠點率、再生愈傷組織頻率、小植株再生強度統(tǒng)計數據及方差分析結果如表6所示。

表6 4種培養(yǎng)基對‘新農1號’狗牙根愈傷分化的影響Table 6 Analysis of four medium’s effect on callus differentiation of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

由表6可知，在‘新農1號’狗牙根分化階段，MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基上的綠點率最高為86.67%，顯著高于1/2MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基(P<0.05)，而極顯著高于MS分化培養(yǎng)基和1/2MS分化培養(yǎng)基(P<0.01)，且未添加6-BA的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)在后期的分化過程中出現(xiàn)大量的毛狀根，愈傷逐漸褐化，直至死亡，因此最終小植株形成強度和再生愈傷組織頻率較低；接種在MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基上的胚型愈傷的小植株形成強度和再生愈傷頻率都極顯著高于1/2MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養(yǎng)基(P<0.01)，其中再生愈傷頻率最高為24.45%，小植株形成強度最高為49.44%。綜合分析認為，‘新農1號’狗牙根的優(yōu)化分化培養(yǎng)基為添加1.0 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基。

2.4 再生苗的生根與移栽

轉入分化培養(yǎng)基大約10～15 d，部分分化培養(yǎng)基上逐漸出現(xiàn)綠點(圖3-a)，20～25 d再生出叢生狀的再生綠色植株(圖3-b)，還有一些分化培養(yǎng)基上的愈傷長出毛狀根并逐漸褐化直至死亡(圖3-c)。將分化的再生綠色植株轉移至無植物生長調節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，15 d后移栽到含有砂質土壤的花盆中(圖3-d)，移栽成活率可達到100%。

圖3 ‘新農1號’狗牙根的分化與再生
Fig.3 Regeneration and transplantation of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

3 討論

植物生長調節(jié)劑、各種外源添加物以及培養(yǎng)基種類都會對愈傷組織的誘導、分化及小植株的再生產生影響，植物生長調節(jié)劑是其中一個最關鍵的因素，調節(jié)激素種類和水平，可以很大程度上優(yōu)化組培再生體系。但是在具體試驗中，激素種類以及濃度組合錯綜復雜，單因素試驗往往會錯過最佳組合。實踐證明，采用正交設計對‘新農1號’狗牙根進行愈傷組織誘導配方的優(yōu)化，是一個切實可行的方法，能夠發(fā)揮正交設計的優(yōu)勢：即用最少的處理得到最佳的組合；另一方面可以確定組織培養(yǎng)各個階段的關鍵因素[20]。國內已有將正交設計法應用于草坪草組織培養(yǎng)，揭示愈傷誘導階段各因素的作用效果的相對大小，并篩選出合理培養(yǎng)條件的研究報道[18-19]。本研究首次將正交法應用于草坪草愈傷組織的繼代培養(yǎng)中，具有重要的實踐意義。

提高愈傷誘導率是優(yōu)化‘新農1號’狗牙根再生體系的第一步，沒有高頻的誘導率，就無法得到大量的、高品質的愈傷組織，其隨后分化得到的再生植株也就少。從目前狗牙根組織培養(yǎng)相關研究文獻來看，比較一致的觀點是2,4-D是愈傷誘導階段最重要的激素；本試驗證實，愈傷誘導率隨2,4-D濃度升高呈先增后降的趨勢，因此添加2.0 mg·L-12,4-D是愈傷誘導的最適濃度，這與陳瓊以成熟穎果為外植體研究結果一致[14]；但據Chaudhury和Qu[21]的研究來看，以未成熟花序為外植體時低濃度2,4-D更利于愈傷組織的誘導，一般適宜濃度為1.0 mg·L-1,這些都可以證實，不同外植體對2,4-D的敏感程度有所不同。而6-BA對愈傷誘導的作用比2,4-D弱，一般與其他生長素配合使用，可以提高愈傷組織的質量和誘導率[22]。低濃度的6-BA(0.01 mg·L-1)有利于形成淡黃的、緊湊的、有顆粒狀突起的胚性愈傷，但濃度過高反而會抑制愈傷誘導、影響愈傷質量[23]。本研究表明，脯氨酸對愈傷組織的誘導有促進作用，錢海豐等研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸對高羊茅(FestucaelataKeng)愈傷誘導沒有效果,而Shetty曾報道脯氨酸能促進紅頂草(AgrostisalbaL.)愈傷的誘導[24]；Shaoyun Lu的研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸對狗牙根的愈傷誘導具有促進作用[25]，與本試驗結論一致。說明脯氨酸在不同草坪草的愈傷誘導中效果可能不一致，這可能由不同草坪草中內源脯氨酸含量的不同引起的。

繼代培養(yǎng)基中降低生長素與細胞分裂素的比例，對胚性愈傷組織的誘導和植株再生起重要作用[26]，與本試驗的結論一致。本研究結果表明，適當提高6-BA的濃度可顯著提高胚性愈傷的誘導和增殖率，減少褐化。原因可能是6-BA作為外源激素，可改善細胞內源生長素和細胞分裂素的比例，調節(jié)細胞生理生化狀態(tài)，有利于胚性愈傷組織的發(fā)生，從而增加分化頻率[27]。本研究表明，高濃度的ABA可促進胚性愈傷組織的生長，這可能是因為早期胚胎發(fā)育要求高滲條件，而增加ABA含量有利于提高培養(yǎng)基的滲透勢[28]。

狗牙根成熟穎果誘導的愈傷組織存在根先于莖葉發(fā)生的現(xiàn)象，而長出毛狀根后就很難發(fā)育成再生植株了，愈傷很快褐化、變黑。一些作物器官發(fā)生中也常存在這種現(xiàn)象[29-30]。胚性愈傷組織只有轉入到生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)基上，才能發(fā)育為成熟的體細胞胚并形成植株，而6-BA可減少根的發(fā)生，促進愈傷向再生植株的方向發(fā)展[30-31]。因此本試驗中分化培養(yǎng)基未添加2,4-D，而添加了一定量的6-BA。試驗表明，轉入繼代后的胚性愈傷組織轉入到不含激素的培養(yǎng)基以及含有6-BA的培養(yǎng)基中都可分化出再生植株，但是添加6-BA的培養(yǎng)基分化的小植株數量顯著高于未添加6-BA的培養(yǎng)基。這可能是在愈傷誘導和繼代過程中都添加了相對較高濃度的2,4-D，2,4-D的積累使得內源生長素的濃度升高，而生長素與細胞分裂素比例可能控制著根的發(fā)育或者莖的發(fā)育。

4 結論

本研究對‘新農1號’狗牙根進行再生體系的優(yōu)化試驗，得出‘新農1號’狗牙根優(yōu)化的誘導培養(yǎng)基為添加2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.01 mg·L-1)+脯氨酸(200 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基，此時愈傷誘導率達69.5%；愈傷繼代的優(yōu)化培養(yǎng)基為2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基，其胚性愈傷率和愈傷增殖率分別可達71.67%和61.67%，且褐化率較低；優(yōu)化的分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA，小植株形成強度可達49.44%。

本研究優(yōu)化了‘新農1號’狗牙根的再生體系。誘導培養(yǎng)基下的愈傷誘導率差別不大；優(yōu)化的繼代培養(yǎng)基下的胚性愈傷率提高了21.5%，愈傷增殖率提高了20.4%，且褐化率下降了10%；優(yōu)化的分化培養(yǎng)基下小植株強度提高了32.7%。