王海清　胡杏軍　劉芳

【摘要】 目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶8（CDK8）和血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 應(yīng)用二步法免疫組織化學(xué)染色對(duì)70例宮頸癌組織進(jìn)行MMP-9、CDK8及VEGF-C蛋白檢測， 觀察三者表達(dá)情況及其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系， 并分析宮頸癌組織MMP-9表達(dá)與CDK8、VEGF-C表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果 MMP-9、CDK8、VEGF-C在臨床分期Ⅲ期的陽性表達(dá)高于Ⅱ期， 有淋巴轉(zhuǎn)移者的陽性表達(dá)高于無淋巴轉(zhuǎn)移者， 宮頸浸潤深度≥2/3者的陽性表達(dá)高于深度<2/3者， 組織分化低的陽性表達(dá)高于高、中分化， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。宮頸癌組織中MMP-9與CDK8表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.518， P<0.05）， MMP-9與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.657， P<0.05）。結(jié)論 MMP-9、CDK8和VEGF-C的過表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移， 具有正協(xié)同作用。聯(lián)合檢測MMP-9、CDK8和VEGF-C蛋白可作為預(yù)測宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移及評(píng)價(jià)患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 宮頸癌；基質(zhì)金屬蛋白酶9；細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶8；血管內(nèi)皮生長因子C；免疫組織化學(xué)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.25.004

【Abstract】 Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）， cyclin-dependent kinases-8 （CDK8） and vascular endothelial growth factor-C （VEGF-C） in cervical cancer tissue and its clinical significance. Methods The expression of MMP-9， CDK8 and VEGF-C in 70 cases of cervical cancer was detected by two-step immunohistochemical staining. The relationship between the expression of MMP-9， CDK8 and VEGF-C was observed and the expression of MMP-9 was analyzed. CDK8， VEGF-C expression. Observation were made on expressio of the above three proteins and its correlation with clinicopathological features， and analysis was made on correlation between the expression of MMP-9 and the expression of CDK8 and VEGF-C in cervical cancer. Results MMP-9， CDK8， VEGF-C positive expression in clinical stage Ⅲ was higher than that in stage Ⅱ， the positive expression lymphatic metastasis was higher than those without lymph node metastasis， the positive expression of infiltration depth ≥2/3 was higher than those of the cervical depth <2/3， and the positive expression of low tissue differentiation was higher than that of middle-high differentiation. Their difference had statistical significance （P<0.05）. The expression of MMP-9 was positively correlated with the expression of CDK8 in cervical cancer （rs=0.518， P<0.05）， and the expression of MMP-9 was positively correlated with VEGF-C （rs=0.657， P<0.05）. Conclusion The overexpression of MMP-9， CDK8 and VEGF-C promotes the invasion and metastasis of cervical cancer and it has synergistic effect. Combined detection of MMP-9， CDK8 and VEGF-C proteins can be used as a biological marker to predict the invasion and metastasis of cervical cancer and evaluate the prognosis of cervical cancer.

【Key words】 Cervical cancer； Matrix metalloproteinase-9； Cyclin-dependent kinases-8； Vascular endothelial growth factor-C； Immunohistochemistryendprint

癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是宮頸癌的晚期死亡原因之一?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）家族中的MMP-9有助于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展， 須有2個(gè)或以上的功能不同癌基因同時(shí)被激活， 并且在時(shí)空上相互配合[2]。本研究應(yīng)用二步法免疫組織化學(xué)染色從蛋白水平聯(lián)合檢測MMP-9、CDK8及VEGF-C在宮頸癌組織中的表達(dá)， 并探討其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性， 為宮頸癌的早診斷、早治療和預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料 收集2011年1月～2016年5月中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院病理科存檔的宮頸浸潤鱗癌標(biāo)本70例：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例， 伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；病理組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)20例， Ⅱ級(jí)26例， Ⅲ級(jí)24例。腫瘤臨床分期（FIGO， 2000年）：Ⅱ期

27例， Ⅲ期43例?；颊吣挲g21～77歲， 平均年齡49.1歲。所有病例標(biāo)本取檢前均未行放療和化療。每例標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)， 有詳細(xì)的臨床資料和手術(shù)記錄。

1. 2 方法 采用二步法免疫組織化學(xué)染色， 即用型鼠抗人單克隆抗體MMP-9、鼠抗人VEGF-C單克隆抗體（美國Santa Cruz公司產(chǎn)品）， 兔抗人CDK8多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品）， 所用抗體的工作濃度：MMP-9及CDK8為1∶50， VEGF-C為1∶100。所有標(biāo)本經(jīng)福爾馬林溶液固定， 常規(guī)石蠟包埋， 微波抗原修復(fù)， 用已知陽性切片作為陽性對(duì)照， 用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1. 3 判定標(biāo)準(zhǔn) 陽性和陰性根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞染色強(qiáng)度來判定。依陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：無陽性細(xì)胞計(jì)0分， 陽性細(xì)胞≤25%計(jì)1分， 26%～50%計(jì)2分， ≥51%計(jì)3分；依染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色0分， 淺棕色1分， 棕黃色2分， 棕褐色3分。每張片兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘：0分為（-）， 1～2分為（+）， 3～4分

為 （++）， >4分為（+++）。（++）以上定為陽性表達(dá)， 余則為非陽性表達(dá)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 宮頸癌組織MMP-9、CDK8和VEGF-C蛋白的表達(dá)

陽性染色呈棕黃色顆粒或團(tuán)塊狀。MMP-9主要表達(dá)于細(xì)胞漿 （見圖1）， CDK8為核染色細(xì)胞（見圖2）， VEGF-C則在胞漿中表達(dá)（見圖3）。

2. 2 宮頸癌組織MMP-9、CDK8和VEGF-C蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 70例標(biāo)本中MMP-9陽性45例（64.3%）， CDK8陽性52例（74.3%）， VEGF-C陽性49例（70.0%）。MMP-9、CDK8、VEGF-C的表達(dá)與患者的年齡無關(guān)（P>0.05）；MMP-9、CDK8、VEGF-C在臨床分期Ⅲ期的陽性表達(dá)高于Ⅱ期， 有淋巴轉(zhuǎn)移者的陽性表達(dá)高于無淋巴轉(zhuǎn)移者， 宮頸浸潤深度≥2/3者的陽性表達(dá)高于深度<2/3者， 組織分化低的陽性表達(dá)高于高、中分化， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 3 宮頸癌組織MMP-9表達(dá)與CDK8、VEGF-C表達(dá)的關(guān)系 宮頸癌組織中MMP-9與CDK8表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.518， P<0.05）， MMP-9與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.657， P<0.05）。見表2。

3 討論

對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc， ECM）的降解是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的步驟之一， ECM降解的關(guān)鍵酶是MMP。MMPs作為一種蛋白水解酶， 基本上可以降解所有的ECM成分（包括血管基底膜）。MMP-9的活性調(diào)節(jié)失衡， 會(huì)發(fā)生腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[3]。本研究檢測宮頸癌組織中MMP-9的表達(dá)亦發(fā)現(xiàn)：高、中分化宮頸癌中的MMP-9蛋白表達(dá)水平低于低分化宮頸癌， 臨床Ⅱ期宮頸癌MMP-9蛋白表達(dá)水平低于臨床Ⅲ期；提示MMP-9的過度激活在宮頸癌的侵襲中起重要作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌MMP-9蛋白表達(dá)水平低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤， 宮頸浸潤深度<2/3者的宮頸癌中的MMP-9蛋白表達(dá)水平低于深度≥2/3者， 提示MMP-9的過度激活與宮頸癌的惡性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Yu等[4]研究發(fā)現(xiàn)：宮頸癌患者中的MMP-9表達(dá)明顯增強(qiáng)， 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤， 隨著腫瘤浸潤程度的增加， MMP-9的陽性表達(dá)率也明顯增加。與本研究結(jié)果一致。

細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase， CDK）家族是細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的一類分子， 被人們廣泛關(guān)注。CDK8作為CDK家族的成員， 具有調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)變等重要作用。本研究檢測宮頸癌中CDK8的表達(dá)情況顯示：CDK8的表達(dá)與患者的年齡無關(guān)（P>0.05）， 低分化宮頸癌CDK8蛋白表達(dá)水平高于高、中分化宮頸癌， 臨床Ⅲ期宮頸癌CDK8蛋白表達(dá)水平高于臨床Ⅱ期；可能與細(xì)胞增殖紊亂相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌CDK8蛋白表達(dá)水平低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤， 宮頸浸潤深度<2/3的宮頸癌CDK8蛋白表達(dá)水平低于深度≥2/3者， 這與Seo等[5]對(duì)127例結(jié)腸癌患者研究的結(jié)論是基本一致的， 提示CDK8表達(dá)上調(diào)可能在宮頸癌侵襲、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞， 功能最強(qiáng)、特異性最高， 參與實(shí)體瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[6]。VEGF-C有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入靜脈和淋巴管， 促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：VEGF-C蛋白表達(dá)與患者的年齡無關(guān)（P>0.05）。高、中分化鱗癌VEGF-C蛋白表達(dá)低于低分化鱗癌， 臨床Ⅱ期宮頸癌VEGF-C蛋白表達(dá)水平低于臨床Ⅲ期， 無淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤VEGF-C蛋白表達(dá)低于有淋巴轉(zhuǎn)移者。因而認(rèn)為VEGF-C蛋白的高表達(dá)對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有重要影響， 可以作為腫瘤治療和預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。endprint

本組研究提示MMP-9及CDK8過表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移能力和惡性程度增加， 故認(rèn)為在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中， MMP-9及CDK8的異常激活癌基因分別發(fā)揮著不同的作用。在時(shí)間和空間上相互配合， 協(xié)作調(diào)控大多數(shù)的靶基因的表達(dá)， 促進(jìn)了細(xì)胞的癌變和轉(zhuǎn)移。MMP-9酶原被激活后形成Ⅳ型膠原酶， 降解腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁基底膜， 導(dǎo)致毛細(xì)血管新生， 促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中MMP-9表達(dá)和VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)， 提示MMP-9可以調(diào)節(jié)VEGF-C的表達(dá)， 促進(jìn)腫瘤新生血管的形成， 在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。MMP-9和VEGF-C均過表達(dá)時(shí)， 術(shù)中應(yīng)高度警惕淋巴結(jié)的潛在轉(zhuǎn)移， 術(shù)后應(yīng)加強(qiáng)輔助治療， 預(yù)防復(fù)發(fā)。

總之， MMP-9、CDK8和VEGF-C的過表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移， 具有正協(xié)同作用。聯(lián)合檢測MMP-9、CDK8和VEGF-C蛋白可作為預(yù)測宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移及評(píng)價(jià)患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] Back M， Ketelhuth DS. Matrix metalloproteinases in atherot-hrombosis. Progress in Cardiovascular Diseases， 2010， 52（5）： 410-428.

[2] Zaman K， Driscoll R， Hahn D， et al. Monitoring multiple angiogenesis-related molecules in the blood of cancer patients shows a correlation between VEGF-A and MMP-9 levels before treatment and divergent changes after surgical vs. conservative therapy. International Journal of Cancer Journal International Du Cancer， 2006， 118（3）：755-764.

[3] Tapia A， Salamonsen LA， Manuelpillai U， et al. Leukemia inhibitory factor promotes human first trimester extravillous trophoblast adhesion to extracellular matrix and secretion of tissue inhibitor of metalloproteinases-1 and -2. Human Reproduction， 2008， 23（8）：1724-1732.

[4] Yu W， Liu J， Xiong X， et al. Expression of MMP9 and CD147 in invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix and their implication. Pathology Research & Practice， 2009， 205（10）：709-715.

[5] Seo JO， Han SI， Lim SC. Role of CDK8 and beta-catenin in colorectal adenocarcinoma. Oncology Reports， 2010， 24（1）：285.

[6] Tammela T， Zarkada G， Wallgard E， et al. Blocking VEGFR-3 suppresses angiogenic sprouting and vascular network formation. Nature， 2008， 454（7204）：656-660.

[7] Saharinen P， Tammela T， Karkkainen MJ， et al. Lymphatic vasculature： development， molecular regulation and role in tumor metastasis and inflammation. Trends in Immunology， 2004， 25（7）：387-395.

[8] Nair A， Venkatraman M， Maliekal TT， et al. NF-kappaB is constitutively activated in high-grade squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinomas of the human uterine cervix. Oncogene， 2003， 22（1）：50.

[收稿日期：2017-05-11]endprint