蔡艷妮， 朱海萍， 蘇 瑩， 楊培君

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000； 3.山東省東明縣第一中學， 山東 東明 274500)

基于Luminol的發(fā)光體系檢測元胡中延胡索乙素

蔡艷妮1,2， 朱海萍3， 蘇 瑩1,2， 楊培君1,2

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000； 3.山東省東明縣第一中學， 山東 東明 274500)

Luminol-KMnO4-OH-、Luminol-NaIO4和KMnO4-Luminol-H+發(fā)光體系在堿性或酸性條件下能產(chǎn)生化學發(fā)光，加入延胡索乙素后可抑制體系的發(fā)光強度，據(jù)此建立了流動注射-化學發(fā)光檢測元胡中延胡索乙素的分析方法，同時開展了方法驗證和干擾試驗，并對3種體系分別進行了流路及條件優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，Luminol-KMnO4-OH-、Luminol-NaIO4和KMnO4-Luminol-H+體系的相對發(fā)光強度分別與延胡索乙素濃度在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。試驗結(jié)果表明，方法的檢出限分別為0.029 66 μg/mL、0.008 69 μg/mL、0.041 38 μg/mL，平均回收率≥97.66%；檢測樣品中延胡索乙素平均得率分別為0.0618%、0.0612%、0.0611%。所構(gòu)建的3種化學發(fā)光體系的線性檢測范圍寬、檢出限低、精密度好，研究結(jié)果可用于中藥材元胡的品質(zhì)分析與質(zhì)量檢測。

延胡索； 延胡索乙素； Luminol； 化學發(fā)光； 分析檢測

中藥材延胡索，又名元胡，為罌粟科紫蓳屬植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang)的干燥塊莖[1]，主產(chǎn)于浙江東陽、磐安、縉云，江蘇海門、南通，陜西漢中，重慶、安徽部分地區(qū)也有種植。當前，漢中已成為全國三大元胡產(chǎn)區(qū)之首。延胡索含多種生物堿，為主要藥效物質(zhì)基礎；延胡索乙素的鎮(zhèn)痛作用最強，延胡索甲素、丑素次之[2]。據(jù)報道[2-4]，延胡索乙素具有麻醉鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常、抗炎及抗腫瘤等作用，是中醫(yī)臨床常用藥物之一。目前，延胡索生物堿的測定方法主要有高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)[5-7]和紫外分光光度法(UV法)[8]，此外還有薄層掃描法[9-10]和毛細管電泳法[11]等。流動注射-化學發(fā)光(CL-FIA)近年來已應用于藥品成分檢測[12-14]、植物活性成分分析[15-16]等，化學發(fā)光分析檢測延胡索生物堿的研究也有報道[17-18]。

本試驗研究基于魯米諾(Luminol)構(gòu)建了3種化學發(fā)光體系，對延胡索乙素開展分析檢測，以期建立中藥材元胡中延胡索乙素的流動注射-化學發(fā)光檢測方法。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料于2014年5—6月采自陜西省城固縣南樂元胡種植基地，選統(tǒng)貨塊莖，清洗，切片，60 ℃干燥，粉碎，過篩(孔徑0.45 mm)，備用。

1.2 試劑與儀器

延胡索乙素標準品，YA0809YA13，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；Luminol，生物試劑，上海金穗生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；NaOH、KMnO4、NaIO4、Na2CO3、NaHCO3、H2SO4、H3PO4、HNO3以及乙醚、乙醇、乙酸、氯仿等試劑均為分析純，水為超純水。

IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀和IFFM-A型多功能化學發(fā)光檢測器，西安瑞邁分析儀器有限公司；KQ-300DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；MS105DU電子天平，d=0.01 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UPH-Ⅱ-40超純水機，成都超純科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 主要試劑溶液

延胡索乙素標準溶液：準確稱取延胡索乙素標準品1.78 mg，甲醇溶解，純水定容至50 mL容量瓶，得到質(zhì)量濃度為0.0356 mg/mL的標準溶液，置冰箱4 ℃保存，備用。

魯米諾儲備液(6.1×10-4mol/L)：精確稱取0.0108 g Luminol于100 mL容量瓶中，1.0 mol/L的Na2CO3溶解，定容后轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，置冰箱4 ℃保存，7 d后備用。

其他儲備液：KMnO4(1.0×10-2mol/L)，NaIO4(1.0×10-2mol/L)，Na2CO3(1.0 mol/L)，NaOH(1.0 mol/L)，NaHCO3(1.0 mol/L)儲備液等現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 供試樣品液制備

稱取元胡樣品干燥粉末5.0 g，乙醚脫脂后加入體積分數(shù)為50%的乙醇50.0 mL，利用超聲提取45 min(120 W，40 kHz)，重復3次，過濾，蒸干濾液；用體積分數(shù)為5%的冰乙酸50.0 mL使其溶解，經(jīng)氯仿-甲醇(V氯仿︰V甲醇=40︰1，pH=9)萃取，濾過萃取液，蒸干；用20.0mL甲醇溶解，調(diào)樣品溶液pH=9～10；D-101型大孔樹脂分離樣品溶液，體積分數(shù)為70%的乙醇洗脫(流速1.0mL/min，流脫液用量100.0mL)，濃縮，于25mL容量瓶中甲醇定容，備用。

1.3.3 延胡索乙素CL-FIA分析檢測設計

準確移取延胡索乙素標準品溶液5.0mL，于50mL容量瓶純水定容，然后再按一定梯度取量稀釋。3種體系標準曲線的延胡索乙素標品梯度溶液濃度見表1。

表1 延胡索乙素標準品梯度溶液濃度

參考方肇倫[19]FIA流程圖，開啟蠕動泵，儀器預熱約30 min，經(jīng)試驗考察，選擇相對應溶液泵入流通池中，待基線穩(wěn)定后進標樣。流動注射化學發(fā)光分析儀檢測產(chǎn)生的化學發(fā)光信號，Remex軟件處理，電腦記錄數(shù)據(jù)。以空白體系的發(fā)光強度與加入延胡索乙素標準溶液后的發(fā)光強度差值ΔI為縱坐標，延胡索乙素標準溶液濃度為橫坐標，建立標準曲線。

取1.0 mL供試樣品溶液，于100 mL容量瓶中純水定容；取其稀釋液2.5 mL，置250 mL容量瓶純水定容；取最終稀釋后的供試樣品溶液按上述條件進行檢測，計算樣品溶液中延胡索乙素得率。

1.3.4 方法學考察

檢出限試驗：依據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)的建議，在優(yōu)化的條件下，對已知濃度的標準溶液連續(xù)進樣11次，計算標準偏差σ，以3σ和標準曲線斜率的比值作為檢出限。

精密度試驗：在優(yōu)化的條件下，平行檢測已知濃度的延胡索乙素標準品溶液11次，計算RSD。

加樣回收率試驗：取一定量已知濃度的樣品溶液，適量加入已知濃度延胡索乙素標準溶液，按1.3.3節(jié)設計檢測其發(fā)光強度，計算加樣回收率。

2 試驗結(jié)果

2.1 化學發(fā)光動力學曲線及化學發(fā)光條件的優(yōu)化

2.1.1 流路及儀器參數(shù)的選擇

考察不同流路對化學發(fā)光強度的影響，3種體系所選擇的主泵、副泵采樣管的注入溶液有一定差異，調(diào)試直至體系的發(fā)光強度最大，且信號穩(wěn)定。此外，泵流速、負高壓對體系化學發(fā)光強度也有影響，試驗確定適宜的主副泵流速分別為1.34～4.02 mL/min和2.01～5.36 mL/min；選擇的負高壓為500～800 V，增益為1。

2.1.2 化學發(fā)光動力學曲線

化學發(fā)光動力學曲線表明，試驗所建的Luminol-KMnO4-OH-體系的化學發(fā)光強度大約在1.85 s時達到最大值，約7.15 s時衰減到極限(圖1a，A)；以延胡索乙素溶液替換超純水，化學發(fā)光強度減弱(圖1a，B)。Luminol-NaIO4體系的化學發(fā)光約1.8 s后達到最大值，約6.7 s時衰減到極限(圖1b，A)；該反應體系中加入延胡索乙素后，化學發(fā)光信號明顯減弱(圖1b，B)。KMnO4-Luminol-H+體系的化學發(fā)光強度大約在2.55 s時達到最大值，約6.0 s衰減到極限(圖1c，A)；用延胡索乙素溶液替換超純水后，化學發(fā)光強度有減弱(圖1c，B)。

2.1.3 試驗條件的選擇

(1)介質(zhì)及其濃度的選擇

分別以濃度1.0 mol/L的NaOH、Na2CO3、NaHCO3及HNO3、H3PO4、HCl、H2SO4溶液為反應介質(zhì)，考察不同介質(zhì)對Luminol-KMnO4-OH-體系、Luminol-NaIO4體系及KMnO4-Luminol-H+體系化學發(fā)光強度的影響，確定了3種體系的適宜介質(zhì)分別為NaOH、NaOH及H2SO4溶液。為達到發(fā)光體系化學發(fā)光強度最大，不同體系對應的介質(zhì)及濃度表現(xiàn)出的差異如圖2所示。在0.01～2.0 mol/L范圍內(nèi)，隨介質(zhì)濃度的增大，3種發(fā)光體系化學發(fā)光強度均先增大，后減弱。篩選的用于3種體系的反應介質(zhì)及其濃度見表2。

(2)Luminol濃度的選擇

分別考察了Luminol濃度在1.0×10-6～6.0×10-6mol/L、1.0×10-6～1.0×10-4mol/L、2.0×10-5～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)對3種體系化學發(fā)光強度的影響，試驗結(jié)果顯示，隨著Luminol濃度增大，體系的發(fā)光強度增強，當濃度達到一定值時發(fā)光強度不再增強且峰形較好，然而再增加Luminol濃度，各體系發(fā)光強度均減弱，如圖3所示。3種體系選擇的Luminol濃度見表2。

(3)氧化劑濃度的選擇

氧化劑濃度選擇在1.0×10-5～1.5×10-4mol/L、5.0×10-4～3.0×10-3mol/L、2.0×10-4～2.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，分別考察體系組分KMnO4、NaIO4和KMnO4溶液濃度對發(fā)光強度的影響。圖4所示的試驗結(jié)果表明，隨所選氧化劑濃度的增加，對應體系的發(fā)光強度先增強，后減弱(圖4)。篩選的3種體系的氧化劑濃度見表2。

表2 3種體系的試驗條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 標準曲線、精密度和檢出限

2.2.1 標準曲線的建立

參照表1按1.3.3節(jié)的方法，配制延胡索乙素標準品梯度溶液，在優(yōu)化的試驗條件下測定，建立標準曲線。

結(jié)果顯示，在Luminol-KMnO4-OH-體系中，延胡索乙素濃度在0.056 96～0.284 80 μg/mL范圍內(nèi)與發(fā)光強度線性關(guān)系良好(圖5a)，線性方程為ΔI=5381c+389.1(R2=0.9986)；對Luminol-NaIO4體系而言，延胡索乙素濃度在0.011 392～0.034 176 μg/mL范圍內(nèi)與發(fā)光強度線性關(guān)系良好(圖5b)，線性方程ΔI=3335.7c+456.2(R2=0.9959)；而在KMnO4-Luminol-H+體系中，延胡索乙素濃度在0.113 92～0.341 76 μg/mL范圍內(nèi)與發(fā)光強度呈線性關(guān)系(圖5c)，線性方程ΔI=161.52c-6.4(R2=0.9944)。

圖1 化學發(fā)光動力學曲線 圖2 不同介質(zhì)及濃度對體系發(fā)光強度的影響

2.2.2 精密度和檢出限試驗

分別采用Luminol-KMnO4-OH-、Luminol-NaIO4和KMnO4-Luminol-H+體系，對應0.056 96 μg/mL、0.011 392 μg/mL和0.113 92 μg/mL的延胡索乙素標準品溶液平行檢測11次，計算得RSD分別為2.19%、1.30%和1.39%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

根據(jù)IUPAC的建議計算，Luminol-KMnO4-OH-體系的檢出限為0.029 66 μg/mL，Luminol-NaIO4體系檢出限為0.008 69 μg/mL，而KMnO4-Luminol-H+體系的檢出限為0.041 38 μg/mL。

2.3 干擾試驗

為評價Luminol-KMnO4-OH-、Luminol-NaIO4和KMnO4-Luminol-H+體系的選擇性，以發(fā)光強度相對誤差的絕對值≤5%計，考察主要可存在組分[15-17]，在優(yōu)化的條件下，分別以0.170 88 μg/mL、0.011 39 μg/mL和0.113 92 μg/mL的延胡索乙素標準品溶液開展干擾試驗。結(jié)果表明，其可存在因子均未超出允許量，說明所建立的3種發(fā)光檢測體系的抗干擾性好。

圖3 Luminol濃度對不同體系發(fā)光強度的影響 圖4 氧化劑及濃度對體系發(fā)光強度的影響

2.4 樣品分析

按照繪制標準曲線的方法檢測樣品，將測定值代入對應體系的線性回歸方程中，計算供試樣品的濃度及得率，以構(gòu)建的3種體系檢測延胡索乙素的分析結(jié)果見表3。

表3 樣品中延胡索乙素CL-FIA分析結(jié)果(n=3)

因樣品中延胡索乙素含量相對較低，屬于痕量水平，故本試驗對3種體系進行回收率試驗時均采用加樣回收方法。按1.3.4節(jié)的方法，在優(yōu)化的條件下，采用所構(gòu)建的3種檢測體系測定供試溶液(n=9)，并計算加樣回收率，其結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗結(jié)果(n=9)

3 分析與討論

圖5 3種體系的延胡索乙素標準曲線

試驗研究表明，Luminol-KMnO4-OH-、Luminol-NaIO4和KMnO4-Luminol-H+體系，在酸性或堿性條件下產(chǎn)生化學發(fā)光，延胡索乙素有抑制此發(fā)光強度的效應，從而建立了3種化學發(fā)光體系分析檢測延胡索乙素的流動注射-化學發(fā)光方法；在優(yōu)化的條件下，3種體系的相對發(fā)光強度與延胡索乙素濃度在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的3種化學發(fā)光體系線性檢測范圍寬、檢出限低、精密度好，可用于分析檢測元胡中的延胡索乙素。

目前，HPLC是分析檢測延胡索或制劑中延胡索乙素的主要方法。有報道，采用RP-HPLC建立了測定消痛靈中延胡索乙素含量的方法[20]。關(guān)于延胡索生物堿的化學發(fā)光分析檢測研究也有報道，李麗清等[18]研究了高錳酸鉀-硫代硫酸鈉-延胡索乙素化學發(fā)光體系，建立了化學發(fā)光測定延胡索乙素含量的方法；朱海萍等[17]基于Rhodamine B化學發(fā)光劑，建立了Ce4+-Rhodamine B體系分析檢測中藥材延胡索生物堿的CL-FIA方法；同時開展CL-FIA與HPLC檢測結(jié)果比對，結(jié)果顯示CL-FIA的精確性略低于HPLC。目前，關(guān)于以Luminol構(gòu)建的不同化學發(fā)光體系用于環(huán)境檢測[21]、食品飲料檢測[22]，藥物成分[12-23]、維生素[24-25]、生物樣品[26]、生物堿[16]等分析檢測也有報道，且Luminol-KMnO4體系大多數(shù)反應是在堿性介質(zhì)中進行[23,25]。史紅艷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物對Luminol-H2O2-Cu2+體系的化學發(fā)光強度有抑制作用，建立了CL-FIA分析檢測蘇鐵葉黃酮類化合物的方法，并指出CL-FIA的精確性略高于UV。馬明陽[25]研究報道，在堿性條件，維生素B12對Luminol-KMnO4體系的化學發(fā)光強度有顯著的抑制作用，基于此建立了化學發(fā)光測定維生素B12的方法，其線性范圍為7.4×10-8～7.4×10-6mol/L，檢測限為2.0×10-8mol/L，獲得滿意的結(jié)果。

本試驗基于Luminol構(gòu)建的3種化學發(fā)光體系，所測定元胡中延胡索乙素的含量與前人采用HPLC測定的結(jié)果[5-6]相近，且所構(gòu)建的方法具有快捷、靈敏、成本低等優(yōu)點，為中藥材元胡的品質(zhì)分析與質(zhì)量監(jiān)控提供了另一途徑。

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[責任編輯：魏 強]

Determination of tetrahydropalmatine inCorydalisyanhusuoby chemiluminescence systems based on Luminol

CAI Yan-ni1,2, ZHU Hai-ping3, SU Ying1,2, YANG Pei-jun1,2

(1.College of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China; 2.Shaanxi Province Key Laboratory of Bio-Resources, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China; 3.Dongming No.1 Senior of School, Dongming 274500, China)

The three chemiluminescence(CL) systems, including Luminol-KMnO4-OH-, Luminol-NaIO4and KMnO4-Luminol-H+, can produce obvious CL reaction in the alkaline or acidic medium, while the tetrahydropalmatine can inhibit those CL signal of these systems. Based on that, a method was established for detecting the tetrahydropalmatine inCorydalisyanhusuoby chemiluminescence-flow injection analysis (CL-FIA), carried out the method validation and interference test, and 3 kinds of systems had conducted flow and parameter optimization. Under the optimized test conditions, the concentration of tetrahydropalmatin was showing a good linear relationship with the relative luminous intensity in three systems. Above all, detection limit of three systems was 0.029 66 μg/mL, 0.008 69 μg/mL and 0.041 38 μg/mL respectively, and the average rate of recovery was over 97.66%. The average extraction ratio of tetrahydropalmatine in the detecting samples with those three systems was 0.0618%, 0.0612% and 0.0611%, respectively. Based on those results, it was concluded that the established method was showing the wide linear detection range, low detection limit and high precision, and the results can be used to quality analysis ofCorydalisyanhusuo, and detecting tetrahydropalmatine practically inCorydalisyanhusuo.

Corydalisyanhusuo; tetrahydropalmatine; luminol; chemiluminescence; determination

2096-3998(2017)04-0067-08

2017-02-16

2017-04-27

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTTSSF01-02)；陜西省教育廳科研計劃項目(12JS026)

蔡艷妮(1990—)，女，陜西省寶雞市人，陜西理工大學碩士研究生，主要研究方向為植物天然產(chǎn)物；[通信作者]楊培君(1960—)，男，陜西省洋縣人，陜西理工大學教授，碩士生導師，主要研究方向為植物天然產(chǎn)物。

O657.3

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