羅 強(qiáng)， 解修超,2， 陳文強(qiáng),2， 鄧百萬(wàn),2，彭 浩,2， 姜午春， 田越欣

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000; 2.陜西理工大學(xué) 陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000)

陜西寧強(qiáng)鉛鋅尾礦中細(xì)菌的分離、鑒定及金屬離子耐受性評(píng)價(jià)

羅 強(qiáng)1， 解修超1,2， 陳文強(qiáng)1,2， 鄧百萬(wàn)1,2，彭 浩1,2， 姜午春1， 田越欣1

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000; 2.陜西理工大學(xué) 陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000)

對(duì)陜西寧強(qiáng)鉛鋅尾礦附近土壤中的細(xì)菌進(jìn)行分離，研究鉛鋅尾礦附近細(xì)菌對(duì)重金屬離子耐受性，為鉛鋅尾礦污染地區(qū)微生物資源的研究提供理論依據(jù)。采用稀釋涂布法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化，然后進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增與校準(zhǔn)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選擇4種金屬離子(Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+)對(duì)菌株進(jìn)行耐受性研究。結(jié)果表明：從尾礦土壤中共分離純化出12株細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)與16S rRNA測(cè)序結(jié)果，所得菌株分屬葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤球菌屬(Agrococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和紅球菌屬(Rhodococcus)。其中有10株細(xì)菌表現(xiàn)出不同程度耐金屬離子Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+特性，占總檢測(cè)菌株的83.33%。特別是L2，L6，L7，L8這4株細(xì)菌耐金屬離子特性較高，占總檢測(cè)菌株的33.33%。

鉛鋅尾礦； 細(xì)菌； 鑒定； 金屬離子耐受性

在鉛鋅礦工業(yè)生產(chǎn)中總是伴隨著一系列的環(huán)境問(wèn)題，由于尾礦中常含有重金屬離子及部分放射性物質(zhì)，所以會(huì)導(dǎo)致重金屬殘留、空氣污染、水污染等，這對(duì)尾礦周邊的環(huán)境有較高程度的影響[1-3]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)重金屬污染治理大致有3種主要措施，分別為：工程治理、化學(xué)治理及生物治理[4]。其中生物治理及修復(fù)主要表現(xiàn)為植物、微生物以及植物與微生物相結(jié)合的環(huán)境修復(fù)[5]。細(xì)菌對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，是土壤中金屬離子成分調(diào)節(jié)的重要影響因子，對(duì)尾礦及周邊地區(qū)的生物修復(fù)和對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的調(diào)節(jié)起到了至關(guān)重要的作用。

近年來(lái)，關(guān)于土壤和環(huán)境生物修復(fù)及重金屬的富集等方面的研究，已轉(zhuǎn)向尾礦附近微生物的分離，如對(duì)銅礦、鐵礦、鈾礦等，通過(guò)研究這類微生物的生物特性，尋找改變尾礦污染和恢復(fù)尾礦自然環(huán)境的方法。陜西寧強(qiáng)有著特殊的地理位置及豐富的自然礦產(chǎn)資源，研究其尾礦土壤中細(xì)菌的分布情況，在資源保護(hù)及環(huán)境治理方面更是有著重要的意義。陜西省漢中市寧強(qiáng)縣燕子砭鉛鋅尾礦土壤細(xì)菌及其耐受性的研究尚未有報(bào)道，針對(duì)其尾礦中細(xì)菌及金屬離子耐受性進(jìn)行研究，旨在為鉛鋅礦區(qū)尾礦周邊土壤的細(xì)菌分布、極端環(huán)境微生物資源及環(huán)境修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試土樣

取自陜西省漢中市寧強(qiáng)縣燕子砭(N32°54′43.10″E105°56′15.11″)鉛鋅尾礦土壤，在去除表面5 cm浮土后，通過(guò)五點(diǎn)取樣法進(jìn)行采樣，將所取土樣混合作為供試土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.4；

(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.2；

(3)MM培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，牛肉膏1.5 g，酵母浸粉 5.0 g，K2HPO43.0 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，H2O 1000.0 mL，pH 7.3[6]。

1.1.3 儀器及設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F，蘇凈集團(tuán)蘇州凈化設(shè)備有限公司)、生化培養(yǎng)箱(XPX-250BSH-Ⅱ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)5424，德國(guó)Eppendorf)、PCR儀(型號(hào)TC-4000，英國(guó)TECHNE公司)和快速核酸提取儀(FastPrep-245G美國(guó)MP Biomedicals公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的處理及菌株的分離與純化

(1)樣品的處理 將風(fēng)干的尾礦土壤樣品用研缽磨碎，過(guò)篩后取1.0 g土樣溶于9.0 mL無(wú)菌水中，渦旋儀渦旋5 min，取上清液作為10-1菌懸液，并梯度稀釋至10-3備用[7-8]。

(2)菌株的分離與純化 選擇LB和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加入濃度為50.0 mg/L制霉菌素作為抑菌劑[9-11]。采用涂布平板法和平板劃線法分離并純化菌株。

1.2.2 菌株的初步鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定 利用顯微鏡及單染色技術(shù)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，從而獲得細(xì)菌的顯微形態(tài)特征，結(jié)合伯杰細(xì)菌手冊(cè)對(duì)菌株進(jìn)行描述。

(2)分子生物學(xué)檢測(cè) 取菌體置于高頻振蕩管中，加入500.0 μL TE緩沖液和500.0 μL 氯仿∶異戊醇(24∶1)，置于DNA快速提取儀中振蕩1min，速度6.0m/s，顛倒混勻10s，12 000r/min離心2min，上清液即作PCR模板，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA檢測(cè)[12-13]。

①PCR擴(kuò)增及檢測(cè)分析 反應(yīng)組分及用量(50.0μL體系)：MIX，25.0μL；引物27F，1.0μL；引物1492R，1.0μL；DNA模版，2.0μL；ddH2O，21.0μL。

②PCR反應(yīng)引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

③PCR擴(kuò)增程序 94 ℃，5min; 94 ℃，1min，56 ℃，1min，72 ℃，90s，33 個(gè)循環(huán); 72 ℃，10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至上海生工檢測(cè)序列[14]。

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：將菌株的16SrRNA基因序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)并索取登錄號(hào)，選取相似度較高的菌株作為參考菌株，使用Mega5.0進(jìn)行序列校準(zhǔn)，按照近鄰結(jié)合(Neighbor-Joining)聚類，選擇1000個(gè)重復(fù)作Bootstrap值進(jìn)行分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 金屬離子耐受性評(píng)價(jià)

選擇Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+4種常見(jiàn)金屬離子，設(shè)置各金屬離子濃度梯度，進(jìn)行耐受性評(píng)價(jià)[6]。金屬離子濃度如表1所示。

表1 各金屬離子濃度梯度

注： 配制相應(yīng)質(zhì)量濃度的Pb(NO3)2，Cu(NO3)2，Hg(NO3)2，Zn(NO3)2母液，加入至MM固體培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株

金屬離子耐受性實(shí)驗(yàn)。

美國(guó)幼兒身體活動(dòng)的環(huán)境政策中強(qiáng)調(diào)以外部環(huán)境的吸引力激發(fā)幼兒積極主動(dòng)地進(jìn)行身體活動(dòng)或參加體育運(yùn)動(dòng)。為幼兒提供身體活動(dòng)的機(jī)會(huì)是幼兒主動(dòng)參與活動(dòng)的前提；穩(wěn)定、便利的環(huán)境是幼兒身體活動(dòng)的基礎(chǔ)；限制幼兒久坐不動(dòng)行為是增加幼兒身體活動(dòng)的一種有效途徑；教師或保育員的行為對(duì)促進(jìn)或抑制幼兒身體活動(dòng)有著重要影響；體育培訓(xùn)與教育對(duì)于增加家長(zhǎng)與幼兒進(jìn)行身體活動(dòng)具有重要意義。綜上可知，美國(guó)環(huán)境政策從不同方面促進(jìn)幼兒身體活動(dòng)，對(duì)幼兒身體活動(dòng)的政策指導(dǎo)已經(jīng)發(fā)展到比較細(xì)致的方面。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛鋅礦區(qū)尾礦中細(xì)菌的分離

從陜西寧強(qiáng)燕子砭鉛鋅尾礦土壤中共分離得到19株細(xì)菌，經(jīng)比較排重，最終獲得12株細(xì)菌。

2.2 鉛鋅礦區(qū)尾礦中細(xì)菌的初步鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

分離純化出的12株細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征如表2所示。

表2 分離純化的尾礦細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征

表2結(jié)果表明，L1，L3等8株菌株顯微結(jié)構(gòu)呈桿狀，約占總分離菌株的66.67%；L2，L6等4株菌株顯微結(jié)構(gòu)呈球狀，約占總分離菌株的33.33%。L1，L5，L10，L12共4株菌呈油狀，約占所分離菌株的33.33%；L2，L4，L6，L8共4株菌呈乳狀，約占總分離菌株的33.33%；菌株L3呈粉狀，約占總分離菌株的8.33%；L7，L9，L11共3株菌呈膏狀，約占所分離菌株的25.00%。

(1)PCR結(jié)果分析

通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rRNA，結(jié)果如圖1所示。

圖1 鉛鋅尾礦中細(xì)菌16S rRNA電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1表明，陜西寧強(qiáng)鉛鋅礦區(qū)尾礦中分離得到的12株細(xì)菌經(jīng)提取16S rRNA后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均在1500 bp左右，且較為一致，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，雙向測(cè)通后將序列拼接獲得16S rRNA完整序列信息。

(2)系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)并索取登錄號(hào)，根據(jù)BLAST結(jié)果，選擇同源性較高的21株細(xì)菌的16S rRNA序列，利用MEGA5.0通過(guò)最大似然值法和進(jìn)化距離陣法等進(jìn)行近鄰結(jié)合(Neighbor-Joining)聚類，1000個(gè)重復(fù)作Bootstrap值分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖2所示。

注： 樹枝上的數(shù)值為驗(yàn)證可信度，圖左下端標(biāo)尺表示堿基置換頻率，且所有菌株已提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并已獲得登錄號(hào)。圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2結(jié)果表明，菌株L2、L4、L8、L9和L12相應(yīng)與松鼠葡萄球菌、芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌及紅球菌形成一個(gè)分支，驗(yàn)證可信度均達(dá)到100%；采用另外兩種不同的建樹方法(進(jìn)化距離陣法及最大似然值法)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也證實(shí)此分支與鄰位相算法分支完全吻合。L5菌株單獨(dú)分為一支，但與假單胞菌等同源性達(dá)100%。陜西寧強(qiáng)鉛鋅尾礦中分離出的12株細(xì)菌主要分屬：葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤球菌屬(Agrococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和紅球菌屬(Rhodococcus)。

2.3 鉛鋅礦區(qū)尾礦中細(xì)菌耐金屬離子的生長(zhǎng)

用平板劃線法進(jìn)行金屬離子耐受性研究，37 ℃，培養(yǎng)48 h，結(jié)果如表3所示。

表3 細(xì)菌在不同金屬離子濃度下的生長(zhǎng)情況

注： 12株細(xì)菌中只有10株菌顯示出金屬離子耐受性，且每組實(shí)驗(yàn)中有5個(gè)平行對(duì)照；++++表示長(zhǎng)勢(shì)很好；

+++表示長(zhǎng)勢(shì)較好；++表示長(zhǎng)勢(shì)較弱；+表示長(zhǎng)勢(shì)很弱；-表示未長(zhǎng)出。

表3結(jié)果表明，所得細(xì)菌中共10個(gè)菌株耐Pb2+特性較強(qiáng)，其中L1，L2，L4，L7，L8，L10，L11，L12共8個(gè)菌株耐Pb2+特性非常顯著，均達(dá)到了2200.0 mg·L-1以上；L2，L6，L7，L8，L12共5個(gè)菌株耐Cu2+特性較強(qiáng)，其中L7，L8共2個(gè)菌株耐Cu2+特性非常顯著，均達(dá)到了600.0 mg·L-1以上；L2，L6，L8，L9，L11，L12共6個(gè)菌株耐Hg2+特性較強(qiáng)，其中L6，L8共2個(gè)菌株耐Hg2+特性較顯著，均達(dá)到了240.0 mg·L-1以上；L1，L2，L4等共10個(gè)菌株耐Zn2+特性較強(qiáng)，其中L2，L7，L8共3個(gè)株菌耐Zn2+特性非常顯著，均達(dá)到了1200.0 mg·L-1以上；所分離出的L2，L6，L7，L8共4株細(xì)菌具有較高程度的耐Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+特性。

3 討 論

對(duì)陜西寧強(qiáng)燕子砭鉛鋅尾礦土壤中細(xì)菌進(jìn)行了分離、篩選及純化，經(jīng)比較排重后，共分離純化出12株細(xì)菌。通過(guò)菌落形態(tài)觀察、16S rRNA測(cè)序等方法進(jìn)行研究，將序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所得細(xì)菌分屬葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤球菌屬(Agrococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和紅球菌屬(Rhodococcus)等5個(gè)屬。獲得了在金屬離子耐受性方面表現(xiàn)非常突出的高耐受重金屬離子菌株，這對(duì)陜西寧強(qiáng)燕子砭鉛鋅礦區(qū)極端環(huán)境微生物資源的開(kāi)發(fā)與利用具有一定指導(dǎo)意義。

朱靜等人的研究表明，耐金屬離子的細(xì)菌對(duì)Pb2+的最大耐受性可達(dá)2100.0 mg·L-1，對(duì)Zn2+的最大耐受性可達(dá)1200.0 mg·L-1，對(duì)Hg2+的最大耐受性可達(dá)500.0 mg·L-1，對(duì)Cu2+的最大耐受性可達(dá)450.0 mg·L-1[6,15-17]。本研究分離純化得到12株細(xì)菌，其中有10株細(xì)菌表現(xiàn)出不同程度的耐Pb2+，Cu2+，Hg2+，Zn2+金屬離子特性，占總檢測(cè)菌株的83.33%，且菌株耐受性表現(xiàn)為Pb2+>Zn2+>Cu2+>Hg2+。L2，L6，L7，L8共4株細(xì)菌表現(xiàn)出較高程度的耐金屬離子(Pb2+，Cu2+，Zn2+)特性，其中L2和L8屬葡萄球菌屬(Staphylococcus)，L6屬土壤球菌屬(Agrococcus)，L7屬芽孢桿菌屬(Bacillus)，均達(dá)到了耐Pb2+2200.0 mg·L-1, Cu2+600.0 mg·L-1, Zn2+1200.0 mg·L-1以上，占總檢測(cè)菌株的33.33%，顯現(xiàn)出對(duì)鉛鋅尾礦污染環(huán)境很好的生物修復(fù)潛力，可對(duì)尋找高耐受金屬離子菌株、環(huán)境治理、極端環(huán)境微生物資源及生物修復(fù)等提供理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯：李 莉]

Isolation, identification and evaluation of metal ion tolerance of bacteria from lead-zinc tailings in Ning-qiang of Shaanxi

LUO Qiang1, XIE Xiu-chao1,2, CHEN Wen-qiang1,2, DENG Bai-wan1,2, PENG Hao1,2, JIANG Wu-chun1, TIAN Yue-xin1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China; 2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

The bacteria in the soil near the Shaanxi Ning-qiang lead-zinc tailings were isolated, and the heavy metal ion tolerance of the bacteria near the lead-zinc tailings lead was studie. This study aims to provide theoretical basis for the research of microbial resources in the lead zinc tailings contaminated areas. The bacteria were isolated and purified by dilution coating plate method. The 16S rRNA sequences were amplified and calibrated, and phylogenetic trees were constructed. The tolerance of the four kinds of metal ions (Pb2+, Cu2+, Hg2+, Zn2+) were studied. The results show 12 strains of bacteria were isolated and purified from the tailings soil, after the microstructural and morphological observation, combining with the phylogenetic tree constructed by sequencing of 16S rRNA. These bacteria are found inStaphylococcus,Pseudomonas,Agrococcus,BacillusandRhodococcus. In the aspect of metal ion tolerance, 10 strains of bacteria show different degrees of resistance to metal ions Pb2+, Cu2+, Hg2+and Zn2+, accounting for 83.33% of the total detected strains. Especially L2, L6, L7, L8 of the 4 strains of bacteria, tolerance characteristics of metal ions is higher, accounting for 33.33% of the total detected strains.

lead-zinc tailings； bacteria； identification； metal ion tolerance

2096-3998(2017)04-0075-06

2017-04-29

2017-05-27

陜西理工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(SLGYCX1620)

羅強(qiáng)(1992—)，男，陜西省西安市人，陜西理工大學(xué)碩士研究生，主要研究方向?yàn)槲⑸镔Y源保育及開(kāi)發(fā)；[通信作者]解修超(1978—)，男，山東省臨沭縣人，陜西理工大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向?yàn)槲⑸锎x產(chǎn)物活性物質(zhì)。

Q938

A