馬 倩，張權(quán)威，隋進(jìn)廷，謝希賢

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457； 3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

谷氨酸棒桿菌分支鏈氨基酸合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

馬 倩1,2,3，張權(quán)威1，隋進(jìn)廷1，謝希賢1,2,3

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457； 3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

谷氨酸棒桿菌中存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，其調(diào)控機(jī)制不清晰的問題嚴(yán)重制約著代謝工程策略的選擇與應(yīng)用.目前，針對谷氨酸棒桿菌分支鏈氨基酸合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展開了一系列研究，發(fā)現(xiàn)了諸多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其靶向調(diào)控基因，而其具體調(diào)控機(jī)制及不同調(diào)控模塊間的相互作用仍有待進(jìn)行深入研究.隨著轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入研究，將為谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造提供更有方向性的指導(dǎo).目前，對谷氨酸棒桿菌中心碳代謝、分支鏈氨基酸合成過程中重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行了相應(yīng)的介紹.

谷氨酸棒桿菌；組學(xué)；代謝工程

隨著基因組測序和代謝途徑分析技術(shù)的發(fā)展，人們獲得了谷氨酸棒桿菌較為清晰的代謝途徑信息，并以此為基礎(chǔ)對代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)改造，以實(shí)現(xiàn)特定產(chǎn)品的高效合成.然而，谷氨酸棒桿菌中存在精細(xì)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，通過影響相關(guān)基因的表達(dá)，對人為代謝干預(yù)或環(huán)境刺激產(chǎn)生內(nèi)部調(diào)控[1-2]，進(jìn)而影響局部代謝途徑改造的效果與穩(wěn)定性，導(dǎo)致很多基因工程菌難以成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程.因此，對谷氨酸棒桿菌進(jìn)行深入的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，闡釋細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，是指導(dǎo)代謝工程改造，充分發(fā)揮谷氨酸棒桿菌的工業(yè)應(yīng)用優(yōu)勢進(jìn)行新產(chǎn)品開發(fā)的迫切需求.系統(tǒng)生物學(xué)研究手段包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和通量組學(xué)等，可以獲得研究對象整體代謝途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息[3].將組學(xué)應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，可以為進(jìn)一步的代謝工程改造提供信息基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)[4].

在轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中，系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)揮著重要的作用[5-6].轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)，通常基于基因組的生物信息學(xué)分析；其靶向調(diào)控基因的發(fā)現(xiàn)，可以通過對比該轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因缺失株與對照組的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等組學(xué)變化[5]，并結(jié)合后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.而對轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的深入研究，更需要結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控引發(fā)的蛋白質(zhì)表達(dá)、代謝物積累等變化來探索上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控與下游代謝的相互聯(lián)系，剖析轉(zhuǎn)錄調(diào)控的引發(fā)、過程與結(jié)果[4]，因而需要結(jié)合蛋白組、代謝組等研究手段開展研究.

1 分支鏈氨基酸的微生物合成

分支鏈氨基酸包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，這些均為人體所需的必需氨基酸，只能通過外界攝取獲得.它們不僅具有調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和免疫力的功能，還能增加機(jī)體運(yùn)動中蛋白質(zhì)的合成，降低肌肉蛋白的分解和損傷.同時也是一類廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料行業(yè)中的營養(yǎng)補(bǔ)充劑[7].因而，分支鏈氨基酸(L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸)作為高附加值的氨基酸產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域.

谷氨酸棒桿菌在分支鏈氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用.谷氨酸棒桿菌中分支鏈氨基酸的合成從丙酮酸出發(fā)[8]，經(jīng)過一系列相同或相關(guān)酶的催化，最終形成具有高附加值的不同分支鏈氨基酸產(chǎn)品.分支鏈氨基酸在合成路徑與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，存在諸多相同酶的催化，相互聯(lián)系緊密.其中，L-纈氨酸與L-異亮氨酸合成的最后四步反應(yīng)均分別由乙酰羥酸合酶(Acetohydroxy acid synthase，AHAS)、乙酰羥酸同分異構(gòu)體還原酶(Acetohydroxy acid isomeroreductase，AHAIR)、二羥酸脫水酶(Dihydroxy acid dehydratase，DHAD)和轉(zhuǎn)氨酶(Transaminase，TA)催化.L-纈氨酸與L-亮氨酸的合成路徑中存在共同的中間產(chǎn)物α-酮異戊酸，最后一步轉(zhuǎn)化均由轉(zhuǎn)氨酶TA催化.三種分支鏈氨基酸均通過BrnEF蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，運(yùn)輸至胞外.不同分支鏈氨基酸產(chǎn)品合成的調(diào)控中，存在著密切的相互影響與作用，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LtbR可以抑制leuCD和leuB基因的表達(dá)，影響L-亮氨酸的合成從而影響共同底物的積累(如丙酮酸)，進(jìn)而對L-纈氨酸和L-異亮氨酸的合成產(chǎn)生影響.谷氨酸棒桿菌中分支鏈氨基酸的合成途徑為[9]

2 分支鏈氨基酸合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究現(xiàn)狀

轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與相應(yīng)靶基因的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上強(qiáng)化或抑制靶基因的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)代謝過程的調(diào)控.按照轉(zhuǎn)錄調(diào)控的范圍大小，分為全局調(diào)控、主調(diào)控和局部調(diào)控三種類型，不同類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間存在著層級調(diào)控，形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10-11].基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的代謝工程改造，在提高菌株性能、獲得優(yōu)良性狀方面，已經(jīng)表現(xiàn)出重要的作用[10,12-13].如來源于耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)中的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IrrE已經(jīng)被成功用于多種微生物抗逆模塊的構(gòu)建[14].目前，在谷氨酸棒桿菌中，逐漸開展了轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)研究[5,15]，已利用基因組生物信息學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)159 個編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因[11]，它們構(gòu)成了谷氨酸棒桿菌中必需的最小轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過層級調(diào)控影響近3 000 個蛋白編碼基因的表達(dá)[16].具體到分支鏈氨基酸的合成，已發(fā)現(xiàn)的與中心碳代謝、分支代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子主要有GlxR，SugR，RamA，RamB，GntR1/2，LtbR和Lrp等.這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的特性以及它們調(diào)控的與分支鏈氨基酸合成相關(guān)的基因如表1所示.其中，GlxR是一個全局調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控的過程包括糖吸收、糖酵解與糖異生，乙酸、乳酸和葡萄糖酸代謝，芳香化合物降解，有氧與無氧呼吸，谷氨酸吸收與氮素同化，脂肪酸合成，脫氧核苷酸合成，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等[11].SugR，RamA和RamB主要調(diào)控碳代謝，GntR1/2與細(xì)胞內(nèi)葡萄糖酸代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程有關(guān)[5].從表1中可以看出：涉及中心碳代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控較為復(fù)雜，GlxR，SugR，RamA，RamB和GntR1/2協(xié)同調(diào)控中心碳代謝過程，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間存在著層級調(diào)控[16].Lrp主要調(diào)控分支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，表現(xiàn)為促進(jìn)brnEF基因的表達(dá)，Yin等[14]發(fā)現(xiàn)Lrp與BrnEF的共同過量表達(dá)，可以同時促進(jìn)lysC，hom，thrB，ilvA和ilvBN等基因的表達(dá)，從而提高了L-異亮氨酸的合成效率.LtbR可以抑制leuB，leuCD和trpE基因的表達(dá)，從而影響L-亮氨酸和L-色氨酸的合成[17].從較簡單的局部轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究出發(fā)，探究其調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步探究局部調(diào)控與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊的相互影響與作用關(guān)系，是逐漸獲得清晰的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息的有效手段.

表1 谷氨酸棒桿菌中與分支鏈氨基酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子信息1)

注：1) “+”表示增強(qiáng)作用；“-”表示抑制作用.

3 基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分支鏈氨基酸代謝工程改造

目前，基于一些簡單轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程開展的代謝工程改造已經(jīng)取得了一些成果，如Yin等[14]通過將L-異亮氨酸生產(chǎn)菌中轉(zhuǎn)運(yùn)L-異亮氨酸雙組分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BrnEF的操縱子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lrp單獨(dú)或組合克隆到穿梭載體pDXW-8中，使L-異亮氨酸的產(chǎn)量提高了63%.Brune等[17]發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Cg1486(目前稱為LtbR)缺失突變株中編碼亮氨酸生物合成途徑酶的leuB和leuCD基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，通過RT-PCR檢測顯示leuC和leuD基因表達(dá)量增強(qiáng)約100 倍，leuB基因表達(dá)量增強(qiáng)11.8 倍.Vogt等[18]通過敲除leuBCD基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子LtbR增強(qiáng)leuBCD的表達(dá)量，進(jìn)一步敲除編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因IolR使葡萄糖的攝取量增加，最終在補(bǔ)料分批條件下，L-亮氨酸積累量超過24 g/L，接近L-亮氨酸在水中的最大溶解度.Chen等[19]則將Lrp調(diào)控與L-纈氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶改造相結(jié)合，通過切斷平行的相關(guān)支路及過表達(dá)ilvB，ilvN和ilvC等關(guān)鍵酶基因，大大提高了谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-纈氨酸的量.然而，谷氨酸棒桿菌中大部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制以及不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊之間的相互作用關(guān)系仍然不清晰，影響了人們對谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的整體認(rèn)識，并且制約著谷氨酸棒桿菌中代謝工程策略的運(yùn)用以及工業(yè)應(yīng)用的效果.

4 結(jié) 論

谷氨酸棒桿菌中存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，其調(diào)控機(jī)制不清晰的問題嚴(yán)重制約著代謝工程策略的選擇與應(yīng)用.分支鏈氨基酸(L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸)的合成過程將中心碳代謝與分支合成、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過程緊密聯(lián)系起來，因而是研究谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的良好素材.多種組學(xué)研究手段的綜合運(yùn)用，將使谷氨酸棒桿菌基因組的結(jié)構(gòu)和功能更加清晰，進(jìn)而發(fā)展出全面且易于理解的基因組編碼目錄，最終明確轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因編碼的產(chǎn)物是如何共同作用使細(xì)胞的代謝有序進(jìn)行的，并且對于解析谷氨酸棒桿菌整體轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成與相互影響關(guān)系具有重要的作用.利用獲得的生物信息，可以更好地繪制代謝工程改造的藍(lán)圖，為未來代謝改造并使基因產(chǎn)物承擔(dān)新功能提供研究方向，對新產(chǎn)品的開發(fā)、菌株生產(chǎn)能力的提高有望做出巨大貢獻(xiàn).

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

The investigation and trend of the transcriptional regulation for the synthesis of branched chain amino acids inCorynebacteriumglutamicum

MA Qian1,2,3, ZHANG Quanwei1, SUI Jinting1, XIE Xixian1,2,3

(1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 3.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China)

The complicated transcriptional regulation system inCorynebacteriumglutamicum, as well as its unclear regulation mechanism greatly restricted the metabolic engineering strategies applied to engineerC.glutamicum. Nowadays, a series of investigations have been conducted to explore the transcriptional regulation network for the synthesis of branched chain amino acids inC.glutamicum. A number of transcriptional regulators and their targeted regulatory genes have been identified, while the specific regulatory mechanisms and the interaction between different regulatory modules remain to be studied in depth. In this paper, the important transcriptional regulators in the process of carbon metabolism and branched chain amino acid synthesis inCorynebacteriumglutamicumwere introduced.

Corynebacteriumglutamicum; omics; metabolic engineering

2017-04-24

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))主任基金項(xiàng)目(2016IM104)；天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金(2016LG11)；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201710057094)

馬 倩(1987—)，女，山東濰坊人，講師，博士，研究方向?yàn)榘被岚l(fā)酵過程系統(tǒng)生物學(xué)分析，E-mail: qianma1987@tust.edu.cn. 通信作者：謝希賢教授，E-mail: xixianxie@tust.edu.cn.

TQ922

A

1674-2214(2017)03-0158-04