馬利，易駿，吳建國(guó)，黃運(yùn)喜，吳巖斌，吳錦忠

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建教育學(xué)院理科部，福建福州350025）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地墨旱蓮中6個(gè)主要成分的含量

馬利1，易駿2，吳建國(guó)1，黃運(yùn)喜1，吳巖斌1，吳錦忠1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建教育學(xué)院理科部，福建福州350025）

目的建立同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地墨旱蓮藥材中木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯和芹菜素6種化學(xué)成分的HPLC方法。方法采用YMC－Pack ODS－A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm，柱溫為25℃。結(jié)果在上述色譜條件下，木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯和芹菜素獲良好分離，分別在5.5～21.1、6.3～50.3、17.9～71.4、3.8～37.8、4.9～39.4、0.7～5.3 μg／mL內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為102.92%、98.44%、98.85%、100.91%、98.76%、101.94%。結(jié)論該方法穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)便可行，可用于墨旱蓮多種成分的同時(shí)定量分析。

HPLC；墨旱蓮；產(chǎn)地；含量測(cè)定

墨旱蓮是菊科鱧腸屬植物鱧腸（Eclipta prostrata L.）的干燥地上部分，具有滋補(bǔ)肝腎、涼血止血的功效［1］，墨旱蓮的化學(xué)成分主要有黃酮類、噻吩類、三萜皂苷類及香豆草醚類等成分［2］。目前2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)墨旱蓮藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)仍僅限于蟛蜞菊內(nèi)酯單一化學(xué)成分的含量測(cè)定［1］，很難全面反映墨旱蓮藥材整體的質(zhì)量。旱蓮中的黃酮類成分具有抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性［3-5］，如木犀草素、木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素和蒙花苷是墨旱蓮抗骨質(zhì)疏松的主要生物活性成分之一［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定墨旱蓮中5種黃酮類成分和蟛蜞菊內(nèi)酯的HPLC含量測(cè)定方法，為全面控制墨旱蓮藥材的質(zhì)量提供更加可靠的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器LC-20AT系列高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV檢測(cè)器（日本島津公司）；MS105DU電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DFT-200手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥10批墨旱蓮樣品采自福建、廣東、廣西、浙江、江蘇5個(gè)省份，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院吳錦忠教授鑒定為墨旱蓮（Eclipta prostrata L.）。不同產(chǎn)地墨旱蓮編號(hào)、采集樣品地點(diǎn)和日期見表1。木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯和芹菜素為本實(shí)驗(yàn)室從墨旱蓮中分離獲得，純度大于98%；乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；甲醇為分析純（上?；瘜W(xué)試劑總公司）；乙醇為分析純（上?；瘜W(xué)試劑總公司）；超純水為Milli-Q超純水機(jī)制備（法國(guó)Millipore公司）。

表1 墨旱蓮藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件YMC－Pack ODS－A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相組成為乙腈（A）-0.2%甲酸水（B），梯度洗脫：程序見表2；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備分別稱取木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素和蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.3 供試樣品溶液的制備取70℃干燥恒重的墨旱蓮藥材粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%乙醇50 mL，回流提取2 h，過濾，濾液50℃減壓濃縮，用80%甲醇定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得?；旌蠈?duì)照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品及供試品HPLC色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍分別精密移取上述混合對(duì)照品溶液，加80%甲醇稀釋，稀釋成不同倍數(shù)，得一系列對(duì)照品混合溶液，搖勻。在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以各成分峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和線性范圍，見表3。

表3 6個(gè)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算結(jié)果顯示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯和芹菜素峰面積的RSD值分別為0.089%、0.144%、0.077%、0.492%、0.132%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批墨旱蓮樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯和芹菜素的結(jié)果分別為0.691%、0.273%、0.373%、0.279%、0.179%和0.290%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批墨旱蓮樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，記錄峰面積。計(jì)算結(jié)果顯示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯和芹菜素的RSD值分別為2.65%、1.70%、1.52%、2.96%、0.97%和2.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)取已知含有量的樣品（編號(hào)8），精密稱取6份，分別精密加入一定量對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率?；厥章式Y(jié)果顯示：木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯和芹菜素的平均回收率分別為102.92%、98.44%、98.85%、100.91%、98.76%、101.94%，RSD分別為2.54%、1.93%、2.47%、1.49%、2.38%、1.06%、2.84%、2.29%，表明6個(gè)化合物的加樣回收率良好。

2.9 樣品含量的測(cè)定取不同產(chǎn)地的墨旱蓮藥材各1 g，以“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析測(cè)定，每批樣品測(cè)定3份，以平均值為測(cè)定結(jié)果，見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）mg／g

3 討論

采用本文建立的分析方法對(duì)10批不同產(chǎn)地墨旱蓮藥材進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果表明：不同產(chǎn)地墨旱蓮中6個(gè)主要成分的含量具有顯著性差異，木犀草苷含量為0.177～2.346 mg／g，芹菜苷含量為0.168～1.125 mg／g，蒙花苷含量為0.924～9.880 mg／g，木犀草素含量為0.064～0.266 mg／g，蟛蜞菊內(nèi)酯含量為0.792～10.542 mg／g，芹菜素含量為0.012～0.144 mg／g。蟛蜞菊內(nèi)酯為香豆草醚類化合物，是墨旱蓮最具特征的化學(xué)成分，為墨旱蓮藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，2015年版《中國(guó)藥典》［1］規(guī)定墨旱蓮中蟛蜞菊內(nèi)酯含量不得少于0.040%為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。從表4中可以看出，所測(cè)樣品中蟛蜞菊內(nèi)酯的含量均符合藥典規(guī)定，其中江蘇宿遷所產(chǎn)墨旱蓮中的蟛蜞菊內(nèi)酯的量最高，廣東揭陽(yáng)所產(chǎn)墨旱蓮中的蟛蜞菊內(nèi)酯的量最低。墨旱蓮中黃酮類化合物是其抗骨質(zhì)疏松活性成分之一［6］，基于墨旱蓮5種黃酮類成分含量差異，單純以蟛蜞菊內(nèi)酯的含有量來(lái)評(píng)價(jià)墨旱蓮的質(zhì)量是不夠完整的，建議進(jìn)行多指標(biāo)成分的定量測(cè)定來(lái)控制墨旱蓮及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量。本研究為中國(guó)藥典進(jìn)行多指標(biāo)成分控制墨旱蓮質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］國(guó)家典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：374-375.

［2］夏愛軍，李玲，董昕，等.UHPLC-Q-TOF／MS技術(shù)應(yīng)用于中藥旱蓮草化學(xué)成分研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：404-407.

［3］黃運(yùn)喜，易駿，吳建國(guó)，等.鱧腸不同部位抗骨質(zhì)疏松活性及化學(xué)成分比較研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（8）：1229-1232，1298.

［4］王雪梅，張建勝，戴云，等.旱蓮草總黃酮的提取及其體外抗氧化活性研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（2）：356-358.

［5］LIU Q M，ZHAO H Y，ZHONG X K，et al.Eclipta prostrata L. phytochemicals：isolation，structure elucidation，and their antitumor activity［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（11）：4016-4022.

［6］林雄浩，吳錦忠.中藥復(fù)方二至丸的化學(xué)成分及抗骨質(zhì)疏松研究進(jìn)展［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào).2009，25（5）：421-424.

R284.2

A

1000-338X（2017）04-0060-03

2017-04-18

福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015Y0070、2014Y0049）

馬利（1991—），女，2015級(jí)生藥學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事中藥活性成分及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。

吳巖斌（1982—），男，助理研究員。E-mail：wxsq1@163. com