李景，林立

（福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院，福建福州350025）

響應面法優(yōu)選骨碎補總黃酮的超聲提取工藝

李景，林立

（福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院，福建福州350025）

目的優(yōu)選骨碎補總黃酮的超聲提取工藝。方法以總黃酮提取率為指標，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken中心組合設計，運用響應面法對影響總黃酮提取率的超聲時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)和料液比進行優(yōu)化。結(jié)果最佳工藝為超聲時間30 min、提取溫度66℃、乙醇體積分數(shù)64%、料液比1∶92 g／mL。在此工藝條件下，骨碎補總黃酮提取率為4.86%，與理論值4.90%較為相近。結(jié)論優(yōu)選的骨碎補總黃酮超聲提取工藝穩(wěn)定可行，為骨碎補總黃酮的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

骨碎補；總黃酮；超聲提取工藝；響應面法

骨碎補是水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根莖，其性味苦、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有療傷止痛、補腎強骨功效，臨床主要用于跌撲閃挫，筋骨折傷，腎虛腰痛，筋骨痿軟，耳鳴耳聾，牙齒松動等癥。其主要活性成分是以柚皮苷為主的總黃酮，用于治療骨質(zhì)疏松癥，能明顯抑制骨質(zhì)疏松癥導致的骨密度下降，在抑制破骨細胞活性的同時，促進成骨細胞增殖［1-2］。目前骨碎補總黃酮多采用正交設計試驗提?。?-6］，關于響應面法優(yōu)選骨碎補總黃酮超聲提取工藝尚未見報道。響應面分析法能找出各因素的最佳組合和響應最優(yōu)值，最終找出最優(yōu)工藝參數(shù)，有效地解決多變量問題，在中藥學研究領域已得到很好的應用［7-8］。本實驗以總黃酮提取率為指標，采用響應面法優(yōu)選骨碎補總黃酮的提取工藝，為該有效成分開發(fā)利用提供理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UV-9600紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器有限責任公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；DF-15連續(xù)投料粉碎機（大德中藥機械有限公司）。

1.2 試藥骨碎補飲片購自福州九州通大藥房，經(jīng)福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院藥學部劉志芳副主任中藥師鑒定為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根莖；柚皮苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：20120221）；甲醇、乙醇均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準曲線的繪制參照文獻［9］，取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為378 μg／mL的對照品溶液，即得。精密吸取柚皮苷對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，以甲醇為空白，于283 nm處測定吸光度（Y），以吸光度（Y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，得回歸方程：

Y＝0.039X＋0.011r＝0.999 5，

柚皮苷在6.05～24.19 μg／mL內(nèi)線性關系良好。

2.2 骨碎補總黃酮的提取及含量測定取骨碎補粗粉約0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中；加入規(guī)定量不同體積分數(shù)乙醇溶液，在規(guī)定溫度下超聲提取規(guī)定時間，離心，精密吸取提取液2.5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干；殘渣用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。按2.1項下方法進行測定，計算總黃酮得率。

2.3 單因素試驗考察分別考察超聲時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)、料液比等因素對總黃酮提取率的影響，結(jié)果顯示：超聲提取時間30 min、提取溫度約65℃、乙醇體積分數(shù)為60%、料液比1∶90時，總黃酮提取率較大，見圖1。

2.4 響應面優(yōu)化實驗在單因素實驗結(jié)果的基礎上，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，選取超聲時間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分數(shù)（C）和料液比（D）為考察因素，以骨碎補總黃酮得率為響應值，建立四因素三水平共29個實驗，因素水平及編碼見表1，實驗設計結(jié)果見表2。

2.5 建立模型方程與顯著性檢驗在綜合單因素實驗結(jié)果的基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，選取超聲時間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分數(shù)（C）和料液比（D）為考察因素，以骨碎補總黃酮得率為響應值，應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到A、B、C、D與骨碎補總黃酮提取率（T）的二次多項回歸方程：

對擬合方程進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3分析可知：方程模型F值為39.89，P＜0.000 1，具有非常顯著性；失擬項F值為3.65，P＝0.111 7＞0.05，失擬度不顯著；R2＝0.975 5，說明方程擬合度好，試驗誤差小，可以用該模型對試驗結(jié)果進行分析預測。各實驗因素與響應面值的關系不是簡單的線性關系，其中C、AD、BC、A2、B2、C2、D2對骨碎補總黃酮提取率影響非常顯著，A為高度顯著，D為顯著，其他不顯著，各因素對指標的影響大小順序為C＞A＞D＞B。

圖1 超聲時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)及料液比對總黃酮提取率的影響

表1 響應面分析因素水平及編碼

表2 響應面分析試驗設計及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

2.6 響應面圖分析各因素間交互作用對骨碎補總黃酮提取率的影響，見圖2?？煽闯龀晻r間（A）和料液比（D）交互影響非常顯著，表現(xiàn)為曲面陡峭，響應值變化較大，等高線為橢圓形；提取溫度（B）和乙醇體積分數(shù)（C）的交互作用影響次之；其他因素交互作用的影響均不顯著。

2.7 驗證實驗由Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到最佳的提取工藝為：超聲時間29.53 min、提取溫度66.30℃、乙醇體積分數(shù)64.31%、料液比1∶91.71，骨碎補總黃酮提取率理論值為4.90%。為方便實際操作，將提取工藝修正為：超聲時間30 min、提取溫度66℃、乙醇體積分數(shù)64%、料液比1∶92，根據(jù)此條件，進行3次平行驗證實驗，骨碎補總黃酮實際提取率分別為4.84%、4.91%、4.82%，平均值為4.86%，RSD為0.97%，與理論值相對誤差為0.81%，表明該提取工藝穩(wěn)定可行，具有實用價值。

3 討論

在前期實驗中，考察了不同溶劑（甲醇、乙醇）和不同提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響，結(jié)果表明不同溶劑提取率沒有顯著差別，而且提取次數(shù)增多，提取率略有增加但變化不大，故從工業(yè)化生產(chǎn)以及經(jīng)濟效益方面考慮，最后確定以乙醇為提取溶劑，提取2次。

在單因素試驗中，對超聲時間進行考察，從圖1A可知，在提取時間10～30 min時，總黃酮提取率隨時間延長而升高，但超過30 min時，總黃酮提取率隨時間增加而降低，原因可能是由于提取時間過長，乙醇揮發(fā)增多，總黃酮溶出減少；同時超聲時間太長，使骨碎補黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞，從而導致提取率減少。對料液比進行考察，從圖1D可知，在1∶50～1∶90，隨著料液比的增加，總黃酮提取率呈上升趨勢，當超過1∶90時，總黃酮提取率下降，分析其可能由于料液比增大，雜質(zhì)的溶解也同時增多，反而使總黃酮提取率下降。

本實驗在單因素試驗結(jié)果基礎上，采用Box-Behnken試驗設計以及響應面分析法對骨碎補總黃酮的超聲提取工藝進行優(yōu)選，得出最佳工藝條件為：超聲時間30 min、提取溫度66℃、乙醇體積分數(shù)64%、料液比1∶92。在此工藝條件下，總黃酮提取率可達4.86%。該實驗結(jié)果對骨碎補總黃酮的提取研究有一定的參考價值，為骨碎補的資源開發(fā)提供實驗依據(jù)。

圖2 各因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖和等高線圖

［1］劉劍剛，謝雁鳴，趙晉寧，等.骨碎補總黃酮膠囊對實驗性骨質(zhì)疏松癥和鎮(zhèn)痛作用的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2004，10（5）：31-34.

［2］孫金谞，何偉濤，劉康，等.骨碎補總黃酮與骨質(zhì)疏松癥的研究［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2008，14（10）：763-766.

［3］全紅，郭春秋，曲倩文，等.骨碎補提取工藝的實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2009，11（12）：16-17.

［4］劉健偉，陳勇，熊富良，等.骨碎補總黃酮提取和大孔吸附樹脂純化的工藝研究［J］.中國藥學雜志，2006，41（16）：1222-1224.

［5］周瀅，曾志華.燙骨碎補配方顆粒的提取工藝優(yōu)選及其含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（5）：54-56.

［6］張海茹.注射用骨碎補總黃酮制備工藝及質(zhì)量控制方法研究［D］.沈陽：沈陽藥科大學，2007：20-30.

［7］彭曉霞，路莎莎.響應面優(yōu)化法在中藥研究中的應用和發(fā)展［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（19）：296-299.

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R284.1

A

1000-338X（2017）04-0040-03

2017-03-24

李景（1989—），女，藥師，主要從事中藥制劑與分析研究。